黄瓜瓜类蚜传黄化病毒的检测与分析

张广荣 孙述俊 文朝慧 何苏琴

摘要：黄瓜是我国重要的蔬菜种类之一，目前已报道约36种病毒可侵染黄瓜，其中瓜类蚜传黄化病毒（Cucurbit aphid-borne yellows virus，CABYV）平均检出率为0.65%。2021年9月在甘肃省白银地区发生病毒病的黄瓜田，发现叶片呈现黄化、明脉症状黄瓜病株。为明确其病原，采集病株后，采用分子生物学方法对病样进行了检测。RT-PCR及病毒CP基因序列测定分析结果表明，该病样受到瓜类蚜传黄化病毒Cucurbit aphid-borne yellows virus（CABYV）的感染。这是继2017年在甘肃酒泉市瓜州县的甜瓜上检测到CABYV后，在甘肃白银市靖远县的黄瓜上再次检测到该病毒。

关键词：黄瓜；瓜类蚜传黄化病毒；病毒病；白银市

中图分类号：S436.42              文献标志码：A              文章编号：2097-2172（2023）11-1074-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.11.018

Report of Cucurbit Aphid-borne Yellows Virus Infecting Cucumbers

in Baiyin， Gansu Province

ZHANG Guangrong 1， SUN Shujun 1， WEN Zhaohui 2， HE Suqin 3

（1. Baiyin Station of Plant Protection and Quarantine， Baiyin Gansu 730900， China; 2. Technical Centre of Lanzhou

Customs District， Lanzhou Gansu 730010， China; 3. Institute of Plant Protection， Gansu Academy of

Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： Cucumis sativus is one of the important vegetable species in China. To date， nearly 36 viruses have been reported to be able to infect cucumber. Among them， the average detection rate of cucurbit aphid-borne yellows virus（CABYV） is 0.65%. In September 2021， a cucumber plot with viral disease occurred in the Baiyin， Gansu Province， and there was symptoms of yellowing and vein clearing on the leaves from cucumber-diseased plant. The disease strains were collected and tested using molecular biology methods to verify the pathogen. RT-PCR and viral CP gene sequencing analysis showed that the disease sample was infected by the CABYV. CABYV on melons was discovered firstly in Guazhou County， Jiuquan in 2017， which was noticed secondly on cucumbers in Baiyin of Gansu Province in September 2021.

Key words： Cucumis sativus; Cucurbit aphid-borne yellows virus; Virus disease; Baiyin

收稿日期：2023 - 05 - 09；修訂日期：2023 - 06 - 06

基金项目：兰州海关科研项目（LK-2022-004）。

作者简介：张广荣（1965 —），男，甘肃镇原人，高级农艺师，主要从事日光温室蔬菜病虫害防治工作。Email： zgr0815@163.com。

黄瓜（Cucumis sativus）是我国重要的蔬菜种类之一，年均播种面积达122.97万hm2，总产量约  6 623.08万t，播种面积及产量均居世界第1位［1 ］。黄瓜在生产过程中遭受多种病害侵扰，已报道约36种病毒可侵染黄瓜［2 ］，在我国，刘勇等［3 ］采用斑点酶联免疫吸附法（Dot-ELISA）、RT-PCR及PCR扩增、小RNA测序分析等血清学和分子生物学方法，对全国范围内采集的3 283份黄瓜病毒病样本进行检测，共检测到19种病毒，其中检出率最高的4种病毒为黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）、黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV）、小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus， ZYMV）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus， TMV），平均检出率依次为28.97%、21.38%、14.35%和10.20%，而瓜类蚜传黄化病毒（Cucurbit aphid-borne yellows virus， CABYV）平均检出率为0.65%。

CABYV是一种单链正义RNA病毒，属黄症病毒科（Luteoviridae）马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus），在田间主要通过棉蚜（Aphis gossypii）、桃蚜（Myzus persicae）和马铃薯长管蚜（Macrosiphum euphorbiae）以持久非增殖型方式传播［4 ］，该病毒还可通过嫁接传播，目前尚未有经汁液机械接种或种子传播的报道［5 ］。CABYV最早于1992年在法国首次报道［4 ］，目前我国北京、上海、浙江、江苏、河南、辽宁、陕西、甘肃、内蒙古、云南、新疆等省（市、区）均有发生［3， 6 - 8 ］。2017年在甘肃瓜州地区的甜瓜上检测到该病毒［8 ］。

2021年9月在甘肃省白银市靖远县北湾镇新坪村的温室大棚中，发现了表现叶片黄化和明脉等病毒病症状的黄瓜植株。为明确其病原，采用PCR方法对病样进行了检测，以期为黄瓜病害的防治提供参考。

1   材料与方法

1.1   病害症状及病情调查

依据田间症状进行病害症状描述，调查黄瓜棚内表现典型病毒病症状的瓜苗病株率，采用Z字形5点取样，每点调查2垄（30株/垄）。

病株率=（病株数/调查植株总数）×100%

1.2   样品采集

于2021年9月上旬（黄瓜苗期），自靖远县北湾镇新坪村大棚黄瓜田（种植黄瓜品种为德尔688，由天津德瑞特种业有限公司提供）采集叶片黄化、明脉的典型病株1份，置于洁净塑料袋中，-80 ℃冰箱保存备用。采样过程中发现棚内有烟粉虱和蚜虫发生。

1.3   引物

参照文献Deng 等［9 ］、Juarez等［10 ］的方法分别合成粉虱传双生病毒（whitefly-transmitted geminivirus， WTG）的通用引物和瓜类蚜传黄化病毒（CABYV）的特异性引物（表1），引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.4   DNA提取和PCR检测

黄瓜叶片总DNA采用［宝生物工程（大连）有限公司］的植物基因组提取试剂盒提取，根据说明书进行操作，同时提取健康黄瓜叶片总DNA，作为健康对照。

PCR反应体系为：2.5 μL 10×PCR反应缓冲液（含Mg2+）、2.0  μL dNTP（2.5 μmol/L）、1.0 μL引物PA（10 μmol/L）、1.0 μL 引物PB（10 μmol/L）、0.5 μL Taq酶、2.0 μL植物总DNA，ddH2O补足体积至25.0 μL。扩增程序为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。

1.5   RNA提取和RT-PCR检测

黄瓜叶片总RNA提取采用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，根据制造商［宝生物工程（大连）有限公司］的说明书进行操作，同时提取健康黄瓜叶片总RNA，作为健康对照。

RT-PCR反应体系为：12.5 μL 2×一步法RT-PCR反应缓冲液、1.0 μL酶、1.0 μL引物CE-9（10 μmol/L）、1.0  μL引物CE-10（10 μmol/L）、3 μL植物总RNA、6.5 μL ddH2O。扩增程序为：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 40 s、72 ℃1 min，35个循环；72 ℃ 8 min。

将PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳分析，并在紫外灯下切取含目的片段的凝胶。

利用爱思进Axygen DNA凝胶回收试剂盒纯化回收DNA片段，将纯化回收的PCR产物连接到pMD18-T载体，然后将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并将转化后的菌液涂布于LB培养基上生长，挑选阳性克隆，送金唯智生物科技有限公司进行测序。

1.6   序列分析

将测序得到的核苷酸序列在NCBI上进行BLAST比对，并下载相关序列（表2）。将文献报道的部分CP序列作为分类标准［11 ］，甜瓜蚜传黄化病毒（Melon aphid-borne yellows virus， MABYV）的CP序列作为外群，采用MEGA X软件中的邻接法（Neighbour Joining， NJ）构建CP基因核苷酸系统发育树，进行1 000次Bootstrap检验计算系统树中节点的置信度。将测序得到的核酸序列编码的外壳蛋白（coat protein， CP）序列在NCBI上进行BLAST比对，采用MEGA X软件中的最大似然法（Maximum Likelihood， ML）构建CP基因氨基酸系统发育树，进行1 000次Bootstrap检验计算系统树中节点的置信度。

2   结果与分析

2.1   黄瓜样品症状

采样大棚的黄瓜田发病株率为0.3%，罹病黄瓜植株的叶片表现明显的黄化、明脉癥状（图1）。

2.2   PCR检测

利用WTG通用引物（PA和PB）对田间采集的病样进行检测，在发病黄瓜样品及健康对照中均未扩增到目标条带（数据未显示）。表明该黄瓜样品中不存在WTG感染。

2.3   RT-PCR检测

以CABYV特异性引物进行的RT-PCR扩增结果显示，在黄瓜病样中扩增出约600 bp的特异性条带，健康样品和空白对照未扩增到目标条带（图2），表明该黄瓜病样中存在CABYV的感染。病样PCR产物纯化后进行序列测定，序列比对分析结果表明，该序列（GenBank登录号：OQ913376）与已报道的福建南瓜上分离物CABYV-FJCP基因的核苷酸序列（GenBank登录号：GQ221223）的同源性为98.33%、氨基酸序列的同源性为98.48%，证明所测定的序列为CABYV的CP基因部分序 列［11 ］。

2.4   CABYV的系统进化分析

在基于CP基因序列构建的系统发育树中，本研究获得的CABYV分离物（GenBank登录号：OQ913376）和瓜类蚜传黄化病毒（如KR231953.1、KR231943.1、KR231944.1、KR231952.1等）均聚为同一分支，即亚洲分支（图3、图4），与福建分离物（GenBank登录号：GQ221223）、新疆分离物（GenBank登录号：EU636992）及韩国分离物（GenBank登录号：KR231952）的亲缘关系较近，聚在亚洲分支，而与欧洲（地中海分支）及中国台湾（台湾分支）分离物的亲缘关系较远。

3   讨论与结论

Kwak等［11 ］测定了2013 — 2014年从韩国出现黄化症状的植株上收集的22个CABYV分离物的完整基因组序列，并与之前报道的CABYV基因组序列进行比较。其研究结果显示，根据完整核苷酸序列的系统发育分析，CABYV可分为4个分支，即亚洲分支、地中海分支、台湾分支和CABYV-R分支。通过分析CP基因序列的相似性，本研究获得的白银CABYV分离物与亚洲分支聚集在一起。

除了葫芦科作物（Cucurbitaceae），莴苣（Lactuca sativa）、蚕豆（Vicia faba）、鹰嘴豆（Cicer arietinum）、西番莲（Passiflora spp.）以及部分葫芦科、锦葵科（Malvaceae）、苋科（Amaranthaceae）、十字花科（Brassicaceae）、藜科（Chenopodiaceae）、唇形科（Lamiaceae）的野生植物也是CABYV的自然寄 主［16 - 20 ］，在病毒传播中起到病毒库的重要作用。CABYV主要引起葫芦科植物，如黄瓜、甜瓜、西瓜、西葫芦、南瓜和苦瓜等叶片黄化和增厚，在果实上症状不明显，但感染后会导致花和绿叶面积减少，致使果实产量降低。在黄瓜中，产量损失可高达50%［21 ］。

本研究是继吴洋等［8 ］2017年在甘肃酒泉市瓜州县甜瓜上检测到CABYV后，在甘肃白银市靖远县黄瓜上再次检测到该病毒，鉴于其具有蚜传特征，同时也可以随着种苗调运等途径远距离扩散危害，生产上应密切关注，加强种苗监测，早发现，早防控，减少对产业健康发展造成的危害。通过控制蚜虫，清除杂草等可减少或推迟CABYV病毒的传播和扩散；有针对性地筛选和利用抗性品种，也是病害防控的有效措施。

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