巨噬细胞极化在腱骨愈合中的研究进展

李建 甄东 郭彩芬

正常肌腱止点是一系列高度特异排序的组织，包括骨、钙化的纤维软骨层、非钙化的纤维软骨层和肌腱[1]。这一结构在力学传导中能避免应力集中，提供足够的强度[2]。手术修复是腱骨界面损伤的主要治疗手段，术中为了促进腱骨愈合需要对骨及肌腱组织进行新鲜化，清除残留的纤维软骨层，但在愈合过程中腱骨界面的纤维软骨层再生很困难。多项研究表明，通过促进腱骨愈合过程中纤维软骨层形成，能明显提高腱骨愈合后的生物力学强度[3-5]。这说明腱骨愈合的核心问题是肌腱与骨之间纤维软骨层的形成。因此，如何提高腱骨界面纤维软骨层的形成是腱骨愈合的关键。

巨噬细胞参与机体损伤应答，在组织炎症调控、修复中发挥重要作用[2]。在炎症微环境中巨噬细胞可极化为经典活化性巨噬细胞 (M1 型) 和选择活化性巨噬细胞 (M2型)[2]。研究表明，巨噬细胞浸润贯穿腱骨愈合的整个阶段，其功能也随着病情进展而发生改变，在损伤的早期主要以 M1 型巨噬细胞浸润，分泌重组人白细胞介素-1β(human IL-1 beta protein，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α) 等促炎因子，参与清除病原体并促进成纤维细胞增殖，而随后巨噬细胞极化为 M2 型，分泌大量的白介素-10 (interleukin-10，IL-10)、乙型转化生长因子 (transforming growth factor beta，TGF-β) 等抗炎因子促进组织的修复[6-7]。研究发现，诱导 M1 型巨噬细胞极化为具有抗炎作用的 M2 型可降低肌腱损伤后炎症水平，并改善肌腱的生物力学性能[8-9]。因此，诱导巨噬细胞表型改变有望成为治疗腱骨愈合的有效策略。笔者广泛查阅近年国内外有关巨噬细胞极化在腱骨愈合治疗作用的相关研究报道，以“巨噬细胞”“腱骨”“愈合”“腱骨愈合”“机制”作为关键词，在中国知网和万方数据库中进行检索；以“macrophage”“tendon-bone”“healing”“tendon-bone healing”“mechanism”为主题词，在 PubMed、Web of Science、Embase 数据库检索。对巨噬细胞极化在腱骨愈合中的作用进行总结，为后续腱骨愈合的研究提供新思路。

一、腱骨界面的结构和功能

腱骨界面结构复杂，它虽然很窄，大约为 200 μm 至1 mm 之间，却存在典型的四层结构：骨组织、钙化的纤维软骨层、非钙化的纤维软骨层和肌腱。第一层是肌腱/韧带组织，主要由成纤维细胞填充，具有与肌腱/ 韧带相似的力学特性。细胞外基质主要由线状排列的 Ⅰ 型胶原纤维组成[1]。第二层是未钙化的纤维软骨，主要由纤维软骨细胞和细胞外基质组成，纤维软骨细胞沿肌腱方向呈柱状排列，细胞外基质主要由 Ⅱ 型和 Ⅲ 型胶原及少量的蛋白多糖和核心蛋白[1]。第三层是钙化的纤维软骨，细胞主要为肥厚的纤维软骨细胞，细胞外基质主要是 Ⅱ 型胶原[1]。第四层是骨组织，细胞由骨细胞、成骨细胞和破骨细胞组成，细胞外基质为矿化的 Ⅰ 型胶原。

尽管腱骨界面被分为典型的四层结构，且每层结构的组织成分不同，但这四层在结构上是连续的，具有明显的梯度变化特点，使得力学特性也逐渐发生变化，由质硬的骨组织逐渐过渡到柔软的肌腱组织，在力学传导中避免了应力集中，提供足够的强度传导强大的肌肉力量，从而提供一种独特的机制来减少腱骨界面处的应力集中[10-11]。

手术为腱骨界面损伤的主要治疗方法，临床研究表明，将断裂的肌腱通过手术重新至骨组织上，腱骨愈合界面不再是典型的四层结构，而多为瘢痕组织所替代，由于瘢痕组织的细胞外基质不规则，弹性降低，缺乏应力分散作用，其生物力学性能显著降低，导致术后再撕裂率增加[11]。腱骨界面的复杂结构奠定了其力学特性的基础[12]。因此，腱骨界面愈合的主要问题是如何恢复腱骨界面的正常梯度结构。

二、巨噬细胞在腱骨愈合中的作用

腱骨愈合包括三个阶段：炎症期、修复期和重塑期[13]。第一阶段为炎症期，主要表现为炎症细胞浸润 (如中性粒细胞和单核细胞)，巨噬细胞吞噬消化坏死物质，持续约 3 天。第二阶段为修复期，本阶段巨噬细胞释放生长因子招募和活化肌腱成纤维细胞，共同合成纤连蛋白、Ⅲ 型胶原蛋白和初始无定形的细胞外基质，而后 Ⅲ 型胶原蛋白逐渐被更牢固的 Ⅰ 型胶原蛋白替代，这一阶段持续约数周。第三阶段为重塑期，此阶段腱细胞的新陈代谢很旺盛，而且腱细胞和胶原纤维开始沿应力方向排列以恢复抗拉强度和肌腱刚度。此外，Ⅲ 型胶原蛋白继续转化为 Ⅰ 型胶原蛋白，肌腱成纤维细胞逐渐分化为成肌纤维细胞。

腱骨愈合是机体内损伤后组织的修复过程，炎症反应在其中起着重要的作用，参与组织修复的巨噬细胞贯穿整个愈合过程，通过分泌各种炎症因子和生长因子调节细胞增殖、分化和细胞外基质形成，在炎症早期阶段，外周血、骨髓和滑膜组织中的 M0 巨噬细胞被募集到腱骨界面，主要极化为 M1 型巨噬细胞，清除坏死物质，如过度活化后会影响腱骨愈合；而在随后的修复和重塑阶段，以M2 型巨噬细胞占主导地位，可促进腱骨愈合[13]。

1.巨噬细胞极化的调控机制：巨噬细胞在不同的环境刺激下可极化为 M1 和 M2 型巨噬细胞。在脂多糖(lipopolysaco haride，LPS)、TNF-α、干扰素 γ (interferon gamma，IFN-γ) 的刺激下，M0 巨噬细胞可极化为 M1 巨噬细胞，同时产生大量的活性氧 (reactive oxygen species，ROS) 和炎症因子 (如 IL-1β、TNF-α、IL-6)[14]。M2 型巨噬细胞可极化为 M2a、M2b、M2c、M2d 四种亚型，每种亚型发挥各自不同的作用。在 IL-4、IL-13 刺激下，巨噬细胞可极化为 M2a 型，并分泌精氨酸酶-1 (arginase-1，Arg-1) 和胰岛素样生长因子-1 (insulin-like growth factor 1，IGF-1) 以促进血管新生和胶原蛋白形成，从而参与细胞外基质的合成，这表明，M2a 巨噬细胞在细胞外基质的合成中是必不可少的[15]。M2b 巨噬细胞的极化可被免疫复合物和 LPS 诱导并表达白细胞分化抗原 86 (cluster of differentiation 86，CD86)、CD68 和主要组织相融复合体 Ⅱ (major histocompatibility complex class Ⅱ，MHCⅡ)CD86、CD68 和 MHCⅡ，其可分泌 IL-10 抑制炎症反应，同时分泌大量的炎症因子 (如 TNF-α、IL-1β)[16]。M2c 巨噬细胞的极化可被糖皮质激素、IL-10 和 TGF-β 诱导，能够分泌 IL-10 和基质金属蛋白酶，调节细胞外基质重塑和纤维化[17]。IL-6 和腺苷可诱导 M2d 巨噬细胞的极化，其分泌转化生长因子 β (transforming growth factor-β，TGF-β)和血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF) 促进肉芽组织的形成[18]。以上研究结果表明，不能将巨噬细胞极化简单地分为 M1 和 M2 型，不同巨噬细胞表型的极化以及在组织愈合中的作用仍需进一步研究。

2.M1 巨噬细胞极化对腱骨愈合的影响：在炎症早期阶段，外周血、骨髓和滑膜组织中的 M0 巨噬细胞被募集到腱骨界面，主要极化为 M1 型巨噬细胞[19]。研究发现，腱骨界面损伤后的第 3 天 M1 巨噬细胞标志物的表达达到峰值，随后逐渐下降[20]。M1 巨噬细胞可以吞噬细胞碎片，清除外来病原体，并通过分泌炎症因子 (IL-1β、TNF-α 和 IL-6) 及趋化因子 [趋化因子配体 2 (chemokine ligand 2，CCL2)、抗人白介素 8 (anti-human IL-8，CXCL8)、基质细胞衍生因子-1 (stromal cell derived factor 1，SDF-1)、CCL2、CXCL8、SDF-1]影响腱骨愈合。

(1) IL-1β 对腱骨愈合的影响：IL-1β 是 M1 巨噬细胞分泌的一种炎症因子，在正常腱骨界面低表达，但在腱骨界面损伤后的瘢痕组织及周围关节液中过表达，表明IL-1β 与腱骨愈合不佳密切相关[21]。体外实验研究表明，IL-1β 可显著降低肌腱干细胞中 Ⅰ 型胶原 mRNA 的表达，并促进人肌腱细胞中环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2，COX-2)、基质金属蛋白酶 1 (matrix metallopeptidase 1，MMP1)、基质金属蛋白酶 3 (matrix metallopeptidase 3，MMP3)、COX-2、MMP1、MMP3 及前列腺素 E2 的表达，从而参与腱骨界面细胞外基质的降解[21]。此外，IL-1β 还可通过核因子 κB (nuclear factor kappa-B，NF-κB) 信号通路影响腱骨愈合，具体机制为通过激活 IκB 激酶 (inhibitor of nuclear factor kappa-B，IKK) 复合体的磷酸化，从而降解 NF-κB 二聚体抑制剂 I-B，使 NF-κB 二聚体转移到细胞核，增加促炎因子基因的表达[21]。在对过表达 IKK 小鼠腱骨界面的研究中发现，IKK 和 NF-κB 在肩袖撕裂患者肌腱组织和小鼠急性肩袖撕裂腱骨界面组织中过表达，腱骨界面 CD68+巨噬细胞大量浸润和纤维软骨明显退变；与野生型或 IKK 过表达小鼠相比，敲除 IKK 基因的小鼠腱骨界面损伤后的愈合能力明显增强，这表明激活 NF-κB 信号通路对腱骨愈合产生了有害影响，这可能与 M1 巨噬细胞浸润及促炎细胞因子分泌增加有关[22]。进一步研究表明，当激活 NF-κB 信号通路时，腱骨界面转录因子 9 (tranion factor sox-9) 的表达减少，从而阻碍了间充质干细胞(mesenchymalstem cells，MSCs) 的成软骨分化，这也表明腱骨愈合不良的关键可能在纤维软骨层[23]。IL-1β 还能诱导腱骨界面破骨细胞的过度活化，导致腱骨愈合过程中骨质丢失和再生不良[24]。综上所述，IL-1β 通过激活 NF-κB信号通路，直接或间接的影响了腱骨愈合，NF-κB 信号通路是腱骨界面愈合不佳重要的信号通路。

(2) TNF-α 对腱骨愈合的影响：TNF-α 也是一种 M1 巨噬细胞在腱骨愈合过程中分泌的炎症因子[25]。研究发现，TNF-α 在撕裂肩袖肌腱组织中的表达明显高于正常肩袖肌腱组织，其可引起肌腱干细胞凋亡、基质金属蛋白酶合成增加及 Ⅰ 型胶原合成减少，从而导致腱骨界面细胞外基质降解[26]。TNF-α 亦可激活 NF-κB 信号通路分泌大量促炎因子，加剧腱骨愈合过程中的炎症反应[27]。在 TNF-α 的诱导下，单核细胞可分化为破骨细胞，引起腱骨愈合过程中骨质丢失[27]。研究表明，下调 Lewis 大鼠腱骨愈合过程中TNF-α 的水平可减少 M1 巨噬细胞的数量，从而诱导纤维软骨层的再生，最终提高腱骨愈合生物力学强度[28]。

(3) IL-6 对腱骨愈合的影响：IL-6 是 NF-κB 信号通路的下游产物，在肩袖撕裂的肌腱组织中大量表达，其在腱骨愈合中发挥双重作用[29]。IL-6 具有抗炎和促炎的双重特性，膜结合受体 IL-6R 介导其抗炎作用，可溶性的IL-6R 介导其促炎作用[30]。研究发现，虽然 IL-6 可以募集单核细胞并促进其分化为破骨细胞，但同时也可以增强IL-1 受体拮抗剂和 IL-10 的释放，以抑制炎症[29]。在 IL-6基因敲除小鼠髌腱损伤模型中，TNF-α 水平高于野生型小鼠，Ⅲ 型胶原与 Ⅰ 型胶原的比值也升高，表明 IL-6 参与了肌腱修复过程中的炎症反应和细胞外基质的重塑，与对照组相比，IL-6 基因敲除小鼠促炎因子 TNF-α 上调，机械性能降低[31]。以上结果表明 IL-6 在腱骨愈合中的作用是复杂的，IL-6 对腱骨愈合的影响有待进一步研究。

(4) 趋化因子对腱骨愈合的影响：M1 巨噬细胞不仅通过分泌炎症因子调控腱骨愈合，还释放趋化因子 (如CCL2、CXCL8、SDF-1) 将 MSCs 募集到损伤部位参与腱骨愈合[32]。研究发现，在小鼠肩袖腱骨愈合模型中，与对照组相比，钻骨道修复组骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 可通过肱骨大结节上的骨隧道浸润到腱骨界面，促进腱骨愈合[33]。Yang 等[34]通过红外荧光成像跟踪技术观察外源性 MSCs 在小鼠腱骨愈合中的分布，建立腱骨愈合模型后，立即向肩关节腔内注射外源性 MSCs，研究发现，于注射后第 3 天腱骨界面出现大量的 MSCs 并促进了腱骨愈合。这些研究均表明，无论是内源性还是外源性 MSCs 均可以被募集到腱骨界面促进腱骨愈合，在此过程中，M1 巨噬细胞释放的趋化因子在募集MSCs 到损伤部位参与腱骨愈合的过程中发挥重要作用。

总之，在腱骨愈合早期，大量 M1 巨噬细胞浸润可以吞噬细胞碎片和外来病原体，同时通过分泌趋化因子将MSCs 招募到腱骨界面，可促进腱骨愈合，但一旦炎症因子分泌过量，局部微环境的炎症反应就会加剧，这对腱骨愈合是有害的。因此，如何精准调控巨噬细胞表型向有利腱骨愈合方法的极化是未来研究的方向和重点。

3.M2 巨噬细胞对腱骨愈合的影响：在肌腱骨愈合的炎症期，巨噬细胞以 M1 型巨噬细胞为主，而在随后的修复和重塑阶段，以 CD206 和 Arg-1 为特征的 M2 型巨噬细胞占主导地位[35]。由于巨噬细胞的可塑性，组织愈合过程中 M2 巨噬细胞可能有两方面的来源，一是 M1 巨噬细胞的复极化，二是 M0 巨噬细胞在 IL-4、IL-13 等刺激下诱导极化而来[35]。与 M1 巨噬细胞相比，M2 巨噬细胞吞噬病原体和产生促炎因子的能力有限，而其释放 IL-4 和 IL-10 等抗炎因子的能力明显增强，这些抗炎因子为腱骨愈合提供了合适的微环境[36]。体外研究表明，M2 巨噬细胞条件培养基可促进 MSCs 成骨分化，但加入 IL-10 中和抗体后，这种成骨作用减弱，这表明 IL-10 是 M2 巨噬细胞发挥腱骨愈合功能的重要因子[37]。M2 巨噬细胞被认为在炎症后期逐渐取代 M1 巨噬细胞，通过分泌各种抗炎和生长因子来调节组织再生。虽然 M2 巨噬细胞通过抑制炎症反应促进腱骨愈合的研究证据相当充分，但 M2 巨噬细胞分泌的生长因子在肌腱 -骨愈合中的作用仍不明确且存在争议。

(1) TGF-β 对腱骨愈合的影响：TGF-β 是一组具有调节细胞生长和分化的 TGF-β 超家族。TGF-β 可通过诱导M2 型巨噬细胞分泌 TGF-β1、TGF-β3 等生长因子形成正反馈调控作用[38]。研究发现，在瘢痕形成和组织再生中，TGF-β 起着决定性作用[39]。在大鼠急性肩袖损伤后腱骨愈合过程中，TGF-β1 在第 10 天时达到峰值，且富含纤维瘢痕组织，其中主要成分为 Ⅲ 型胶原，表明 TGF-β1 参与损伤腱骨界面纤维瘢痕组织的形成[40]。在大鼠急性肩袖损伤模型中，加入外源性 TGF-β1 可促进腱骨愈合，提高生物力学强度，但同时亦增强了 Ⅲ 型胶原蛋白的转录水平，促进纤维瘢痕组织的形成[41]。相反，在腱骨愈合过程中，具有促进纤维软骨形成的 TGF-β3 却低表达[42]。研究发现，在腱骨界面加入 TGF-β3 可促进腱骨界面纤维软骨的再生，从而提高了愈合后的生物力学强度，且瘢痕形成较少。以上结果表明，TGF-β 对腱骨愈合具体重要的作用，通过调节巨噬细胞向 M2 型极化，促进 TGF-β3 的生成可能成为促进腱骨愈合的有效策略。

(2) VEGF 和骨形态发生蛋白-2 (bone morphogenetic protein type 2，BMP-2) 对腱骨愈合的影响：巨噬细胞释放的生长因子 VEGF、BMP-2 也在组织再生中发挥重要作用[43]。在小鼠模型中，硫酸壳聚糖可诱导 M2 巨噬细胞极化，从而促进内源性血管内皮生长因子 VEGF 的表达，从而促进缺血性疾病的血管新生[44]。研究发现，BMSCs 来源的外泌体可诱导 M2 巨噬细胞极化，增加 VEGF 的表达，促进大鼠损伤腱骨界面周围血管新生，有利于腱骨愈合[45]。此外，通过改变蜂窝状二氧化钛的表面形貌来调控 M2 巨噬细胞的极化可以促进巨噬细胞释放更多的BMP-2，以促进小鼠胫骨植骨模型中的成骨[46]。以上结果表明，M2 型巨噬细胞分泌释放 VEGF 和 BMP-2 分别促进血管新生和成骨来提高腱骨愈合质量，其具体机制仍需进一步探索。

三、总结与展望

腱骨界面结构特殊，损伤后腱骨愈合过程复杂，常规手术修复后再撕裂率高。巨噬细胞是促进腱骨愈合的重要靶点，贯穿于腱骨愈合的整个过程，在骨腱界面修复过程中，如何精准调控巨噬细胞在时空顺序向不同表型极化对骨腱界面的愈合至关重要。如何定向诱导巨噬细胞分泌细胞因子充分发挥促进腱骨愈合的作用是发挥临床疗效的关键环节。未来的研究应进一步探索巨噬细胞调控腱骨愈合的机制，利用组织工程技术精确调控巨噬细胞表型，促进腱骨界面愈合。