4 种测定苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸的高效液相色谱法的比较研究★

毛国任，张 明，李跃海，董莉娟，吴明珠，李 应

（1.化工污染防治重庆市高等职业技术院校应用技术推广中心，重庆 401120；2.北大医药股份有限公司安全环保部，重庆 400000）

高效液相色谱仪（HPLC），是利用色谱原理分析高沸点难挥发、受热不稳定、大分子量有机物的仪器[1]。具有分析速度快、重复性好、分辨率高、灵敏度高、精密度高等优点。利用高效液相色谱法可测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量[2]，以及水中的萘酚[3]、药物中的乙酰谷酰胺[4]等，具有使用范围广、重现性好等特点。

苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸是生活中常见的有机物。它们广泛存在于自然界中，可用于食品、药品、化妆品、工业原料[5-6]等。在甲苯的（电）催化氧化中，上述三种物质常存在于同一反应体系中，且化学性质相近，难以定量分析，需要建立一种有效的分离分析方法。此外，芳香醛类化合物的坎尼扎罗反应[7]也会生成芳香醇、芳香酸，三种物质在同一体系中也很难分离分析。

本文从准确定性、精确定量的角度出发，采用高效液相色谱法对苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸进行分析。目前，检测上述三种物质的方法有4 种，其主要区别为流动相的不同[8-9]。通过比较研究发现：流动相为乙腈与甲醇时，分离度较低，无法达到理想结果；流动相为甲醇与水时，只能分出苯甲醛与苯甲酸；流动相为乙腈与水时，只能分离苯甲醇与苯甲醛或苯甲酸与苯甲醛；流动相为乙腈与甲酸（0.02%）溶液时，效果最佳，可以有效地分离分析苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸。最好色谱条件为：流动相，V乙腈∶V0.02%甲酸=40∶60；检测波长，250 nm；柱温，35 ℃；流速，1 mL/min；进样量，10 μL。

1 实验部分

1.1 实验试剂

苯甲醇（AR）、苯甲醛（AR）、苯甲酸（AR），成都市科隆化学品有限公司；甲酸（AR），上海麦克林化工股份有限公司；乙腈（AR），上海星可生化有限公司；一级水，自制。

1.2 实验仪器

日本岛津公司SIL-16 型高效液相色谱仪；检测器：SPD-16;色谱柱：GL Sciences，C18（ODS），5 μm，4.6 mm×250 mm；机械超声波清洗机；真空泵；抽滤瓶。

1.3 样品配制

分别取1 mmol 苯甲醇、苯甲醛与苯甲酸置于3 个100 mL 容量瓶中，用流动相定容，制得10 mmol/L 的苯甲醇、苯甲醛与苯甲酸母液。从3 个10 mmol/L 的母液中分别取1 mL 置于10 mL 容量瓶中用流动相定容，制得1 mmol/L 3 种物质的样品。分别从3 个10 mmol/L 的母液中分别取1 mL 混合于10 mL 容量瓶中用流动相定容制得混合样。特别注意：配制乙腈与0.02%甲酸流动相时，需要将混合溶液超声10 min。

1.4 流动相配制

1.4.1 甲醇与水（表1）

表1 甲醇与水的比例

1.4.2 乙腈与水（表2）

表2 乙腈与水的比例

1.4.3 乙腈与甲醇（表3）

表3 乙腈与甲醇的比例

1.4.4 乙腈与0.02%甲酸（表4）

表4 乙腈与甲酸（0.02%）的比例

1.5 实验方法

色谱条件：检测波长为250 nm，柱温为35 ℃，流速为1 mL/min，进样量为10 μL。

2 结果与讨论

2.1 4 种不同流动相的分离度

2.1.1 甲醇与水作流动相

从表5 中得出，随着甲醇的比例增大，R1与R2逐渐变大，但R1始终小于1.5。表明此法只适合用于测试含有苯甲酸与苯甲醛的混合物，不适合同时含有苯甲醇、苯甲醛和苯甲酸的混合物。

表5 甲醇与水为流动相时混合样的分离度

2.1.2 乙腈与水作流动相

从表6 中得出，随着水的比例减小，R1先变大后变小，R2逐渐变小。当水的比例到40%时R1最大。大部分R 值能大于1.5，但由于水是极性溶液，导致前沿峰出现，不能达到理想分离效果。该法能把苯甲酸或苯甲醇与苯甲醛两两分离。表明可用于测试不同时含有芳香酸与芳香醇的混合物中。

表6 乙腈与水为流动相时混合样的分离度

2.1.3 乙腈与甲醇作流动相

从表7 中得出，甲醇的比例减小，R1和R2无明显变化，且R 值均小于1.5，可能是因为甲醇的极性小于水的极性，用甲醇作水相时，三种物质更难以分离，不能达到良好的测试效果。

表7 乙腈与甲醇为流动相时混合样的分离度

2.1.4 乙腈与0.02%甲酸作流动相

从表8 中得出，0.02%甲酸的比例降低，分离效果变差。当V乙腈∶V0.02%甲酸=4∶6 的时候，分离效果最佳。可能是因为，加入弱酸能调节流动相的pH 值来抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，使峰形有所改善，取得了最佳效果，是4 种方法中最好的。该法可用于测试混合物中同时含有芳香醇、芳香醛、芳香酸。最佳实验结果色谱峰见图1、表9。

图1 混合样的高效液相色谱图

表8 乙腈与甲酸（0.02%）为流动相时混合样的分离度

表9 苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸这三种物质的出峰时间

2.2 标准曲线

从图2-1、图2-2 得出，苯甲醇与苯甲酸在浓度为1，2.5，5，7.5，10 mmol/L 时，所测的标准曲线具有良好的相关性（R2苯甲醇=0.999 5，R2苯甲酸=0.999 6）。但是苯甲醛的浓度为1，2.5，5，7.5，10 mmol/L 时，所测的标准曲线的相关性差（R2苯甲醛=0.907 3），分析图2-3，得出可能是由于苯甲醛在流动相的溶解度较低。于是在图2-3 浓度的基础上将苯甲醛浓度调为0.1、0.25、0.5、0.75、1 mmol/L，由此得出图2-4，发现此浓度下所测的标准曲线的相关性良好（R2苯甲醛=0.999 3）。

图2 标准曲线

3 结论

本文对4 种测定苯甲醛、苯甲酸、苯甲醇的高效液相色谱法进行对比研究，发现当色谱条件为流动相V乙腈∶V0.02%甲酸=4∶6，检测波长为250nm，柱温为35℃，流速为1 mL/min，进样量为10 μL，的测试效果最佳。苯甲醇浓度为1、2.5、5、7.5、10 mmol/L，苯甲醛浓度为0.1、0.25、0.5、0.75、1 mmol/L，苯甲酸浓度为1、2.5、5、7.5、10 mmol/L 时线性效果最好。