花生油中黄曲霉毒素B1的表面增强拉曼光谱快速检测

张悦湘 李永玉 彭彦昆 马劭瑾 王威 吴继峰

（中国农业大学工学院， 北京 100083）

粮油安全一直是国际社会关注的重要问题，其中真菌毒素是较为常见的粮油污染因素[1-2]。目前发现的真菌毒素有400 多种，其中，黄曲霉毒素B1（AFB1）因其高致癌性而成为人们关注的重点，约有25%的动物死亡是由AFB1 污染所引起[3-7]。油料作物从种植到加工食用油的各环节都受到真菌毒素污染的威胁，其中花生和玉米受AFB1 污染占比尤其高[8-10]，我国食品安全国家标准《食品中真菌毒素限量》（GB 2761-2017）[11]明确规定花生油和玉米油中AFB1 含量不得超过0.02 mg/kg。

目前，AFB1 的传统检测方法有高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）、高效液相色谱-荧光检测（HPLC-FD）和酶联免疫吸附（ELISA）法等。传统方法检测精度高，但通常需要使用昂贵的仪器设备和复杂的样品处理过程，不适合大批量样品的快速筛查和现场检测。快速检测方法有电化学生物传感技术和电化学阻抗谱技术（EIS）等，这些方法检出限相对较高，只能用于初筛查[12-14]。因此，迫切需要开发灵敏、高效、经济、快速和稳定的AFB1 检测方法。表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）利用局域表面等离子体共振和化学吸附的方法获得样品分子结构和官能团的指纹信息，常被应用于痕量检测。目前，基于SERS 的AFB1 检测研究多采用适配体探针的间接检测方法。He 等[15]将SH-cDNA 修饰的Fe3O4@Au 纳米花作为捕获探针，SH-Apt 修饰的Au@Ag 纳米球和商用Cy3-Apt 作为报告探针，与SERS 相结合开发了一种高灵敏的花生油中AFB1 检测体系，线性范围为1 ng/kg～0.1 mg/kg，检出限为0.4 ng/kg；Chen 等[16]利用氨基端AFB1 适配体（NH2-DNA1）开发了用于花生油中AFB1 检测的SERS 适配体传感器，线性范围为0.1 μg/kg～0.1 mg/kg， 检出限为36 ng/kg；Jiao 等[17]通过Hg（II）与AFB1的特异性结合，抑制NH2-Rh-Au@Ag CSNP 传感器的聚集，CSNP 传感器拉曼信号降低，从而预测花生油中AFB1 含量，检测范围为1×10‒4～5×10‒3mg/kg，检出限为3×10‒5mg/kg。虽然基于适配体探针的间接检测方法达到了国家标准所要求的检测精度，但存在适配体分子合成复杂和成本昂贵等缺陷。对于直接检测方法，Lin 等[18]将金纳米双锥体（Au NBPs）自组装到阳极氧化铝（AAO）的纳米孔中，合成了高灵敏度的SERS 基底检测花生中AFB1，线性范围为1.5 μg/kg～1.5 mg/kg， 检出限为0.5 μg/kg；Li 等[19]通过在聚二甲基硅氧烷包覆的阳极氧化铝（PDMS@AAO）复合基底表面溅射金纳米粒子（AuNPs），制备了三维椰菜花状SERS 基底用于玉米中AFB1 的检测，线性范围为0.05～1 mg/kg， 检出限为1.8 μg/kg。但是，以上直接检测方法存在SERS 基底制备困难、难以保存以及重现性差等缺陷。此外，目前大多数研究在数据分析方面通常基于单一的拉曼峰进行定量分析，然而目标物的特征峰并不唯一，通过单个峰定量分析会丢失许多重要信息，影响定量分析的准确度。

本研究利用实验室自行研制的液态样品自动混匀SERS 光谱采集系统，以花生油中AFB1 为研究对象，银溶胶为表面增强剂，探究了花生油中AFB1 拉曼信息的直接获取方法，研究了促凝剂等对花生油中AFB1 的SERS 特征信息的影响，建立了花生油中AFB1 的SERS 光谱定量预测模型，最终实现了花生油中AFB1 的快速定量检测，为液态食品中真菌毒素污染检测提供了新的思路和技术参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

实验室自行研制的表面增强拉曼光谱采集系统[20]；TDZ5-WS 低速台式离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；XH-C 漩涡混合器（常州朗越仪器制造有限公司）；MYP11-2A 恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器制造有限公司）。

AgNO3（≥99%，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（分析纯，现代东方科技发展有限公司）；微孔滤膜（0.22 μm，天津津腾实验设备有限公司）；AFB1（99%）、柠檬酸钠（分析纯）和碘化钾（分析纯）购于上海麦克林生化科技有限公司。花生油为市售产品。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

称取AFB1 标准品1 mg 溶于10 mL 乙腈溶液中，制备浓度为100 mg/L 的AFB1 标准储备液。取500 μL 标准储备液加入至花生油中，稀释，制备AFB1 浓度梯度分别为1、0.8、0.5、0.2、0.1、0.08、0.05 和0.02 mg/kg 的花生油样品，每个浓度梯度制备8 个样品，共64 个样品。

1.2.2 表面增强剂银溶胶的制备

参考文献[21]的方法制备银溶胶，以3000 r/min 离心30 min，去除上清液后，收集浓缩约20 倍的银溶胶置于玻璃瓶中，在4 ℃下避光保存备用。

1.2.3 促凝剂的制备

分别制备浓度为0.1、0.5、0.8、1、1.2 和1.5 mol/L 的KI 溶液以及浓度为1 mol/L 的NaCl、MgSO4和K2SO4溶液，用于促进增强剂中的银纳米粒子与AFB1 分子的结合，考察促凝剂的种类和浓度对目标物拉曼信号的影响。

1.3 表面增强拉曼光谱采集系统

实验室自行研制的表面增强拉曼光谱采集系统[20]包括液态样品自动混匀控制模块和拉曼光谱信息采集模块，系统结构如图1A 所示。所研发的液态样品自动混匀控制模块实现了自动进样、振动混匀和到位检测功能，保证待测样品与增强剂、促凝剂自动混匀，并控制试验中样品混合吸附的时间，减小人工操作光谱采集的误差（图1B）。同时，结合拉曼光谱采集模块能最大限度地保证激光与样品的对中性以及激光探头到样品距离的一致性。此采集系统减少了包括人为因素在内的诸多因素对于拉曼光谱信号的影响，保证了SERS 检测程序的标准化和一致性。

图1 （A）表面增强拉曼光谱采集系统；（B）自动混匀装置：（1）拉曼探头，（2）样品板，（3）振动器，（4）步进电机，（5）旋转台，（6）调高旋钮Fig.1 (A)Surface-enhanced Raman spectrum (SERS) acquisition system; (B)Automatic mixing device:(1)Raman probe,(2)Sample version,(3)Vibrator,(4)Stepper motor,(5)Luggage carousel,(6)Adjustment knob

1.4 花生油中AFB1的SERS光谱信息采集

本研究采用QuEChERS 前处理技术[22]，实现较短时间内有效分离提取花生油中的目标物AFB1，进而获取花生油基质中的AFB1 拉曼特征信息。首先移取5 mL 待测花生油样品于50 mL 离心管中，加入20 mL 乙腈-水（84∶16，V/V），超声振荡20 min，6000 r/min 离心10 min，上清液经0.22 μm 有机滤膜过滤后，取3 μL 滴入微量液态样品自动混匀采样装置的样品槽中，再依次滴加表面增强剂银溶胶和促凝剂各3 μL，表面增强拉曼光谱采集系统振动混匀6 s 后自动采集光谱信息，每个样品重复采集3 条光谱，取3 条光谱的平均值作为样品的原始光谱。

1.5 数据处理与分析

为消除暗电流造成的激光斑点大小、激光功率波动及光程变化等物理因素对拉曼光谱产生随机噪声干扰，所有光谱均经过SG（Savitzky-Golay）平滑和标准正态变量变换（Standard normal variate transformation，SNV）预处理。再利用非对称最小二乘[23]（Asymmetric least squares，ALS）进行基线拟合和背景消除，进一步表征目标物的拉曼光谱。偏最小二乘回归（Partial least squares regression，PLSR）作为一种有效的多元统计回归方法被广泛应用于构建具有众多高度可变的共线性模型，适合多变量的光谱信息分析。为评估PLSR 模型性能，通过计算校正集均方根误差（Root mean square error of correction set，RMSEC）、预测集均方根误差（Root mean square error of prediction set，RMSEP）、交叉验证集均方根误差（Root mean square error of cross validation set，RMSECV）、校正集决定系数（Determination coefficient of correction set，R2C）和预测集决定系数（Determination coefficient of prediction set，R2P），以判断和评估模型性能。

为进一步降低光谱信息中的冗余变量对定量预测模型带来的干扰，本研究采用CARS、RF 和SPA算法对全光谱信息进行AFB1 的特征变量筛选，以减化模型和降低模型的过拟合，从而提高模型预测的精准性和稳定性。采用MATLAB R2016b（美国MathWorks 公司）和Origin 2021（美国OriginLab 公司）进行计算和图形绘制。

2 结果与讨论

2.1 AFB1的拉曼特征峰的确定

AFB1 标准品的光谱经ALS 扣除背景后，清晰地显示AFB1 丰富的拉曼特征峰信息，如图2A 所示，采集的AFB1 标准品拉曼特征位移与Liu 等[24]报道的结果相符。基于实验室自行搭建的表面增强拉曼光谱系统采集的浓度为1 mg/L 的AFB1 标准储备液的拉曼光谱如图2B 所示，其中544 cm‒1处特征峰是由C—C—C 环变形产生，694 cm‒1处特征峰是由C—H 键面内弯曲引起，1249 和1276 cm‒1处特征峰分别由C—O 键拉伸振动和C—H2对称振动产生，1626 cm‒1处特征峰是由C=C 键拉伸振动引起[25-26]。相关研究表明，AFB1 分子中内酯环上的碳原子具有较强的亲电性，而银纳米粒子带电，因此AFB1 可以依靠静电吸附至银纳米粒子的电负性表面，从而增强拉曼信号[27]。AFB1 标准品与AFB1 标准储备液的拉曼光谱存在偏移，是由于AFB1 溶于乙腈后分子键发生了改变，并且分子吸附至银纳米粒子表面后电子密度分配发生了扭曲，分子键的极化率被改变，使得光谱中的波段发生了偏移。

2.2 促凝剂对花生油中AFB1检出限的影响

在不同浓度AFB1 提取液中依次滴加银溶胶和促凝剂后，其混合液从棕色转变为灰黑色，在促凝剂的作用下，银纳米粒子凝聚并形成等离子体热点，热点中的等离子体增强电磁场将显著提高AFB1 的拉曼信号强度，并且不同促凝剂会产生不同的银纳米粒子凝聚态。相关研究表明，NaCl、MgSO4、KI、K2SO4、HCl 和NaOH 等溶液都可以作为促凝剂有效提高目标物的拉曼信号[24]，但是AFB1 分子在强酸或强碱环境中会分解，因此常用的HCl 和NaOH 溶液不能作为AFB1 的促凝剂。对比分析不同促凝剂发现，KI 溶液显著增强了AFB1 特征信号强度，杂质分子对AFB1 拉曼信号的干扰相对较少（图3A）。此外，KI 溶液浓度也会影响拉曼光谱信号的强度和稳定性（图3B），当促凝剂KI 溶液浓度为1.2 mol/L 时，544 cm‒1处的AFB1 特征峰增强尤为显著。其中，图3 中促凝剂浓度均为加入时的原始浓度。促凝剂浓度过低时，银纳米粒子的热点形成缓慢，导致检测时间延长，信号不稳定。当KI 溶液浓度过高时，银纳米粒子团聚速度加快，导致聚合物迅速从溶液中沉淀出来，AFB1 的拉曼特征信号反而下降。

图3 （A）使用不同促凝剂的AFB1 提取液的SERS 光谱；（B）加入不同浓度KI 溶液的AFB1 乙腈提取液的SERS 光谱Fig.3 (A)SERS spectra of AFB1 acetonitrile extracts using different procoagulants;(B)SERS spectra of AFB1 acetonitrile extracts with different concentrations of KI solutions

基于实验室自行搭建的表面增强拉曼光谱采集系统，在促凝剂KI 溶液浓度为1.2 mol/L 时，采集了不同浓度花生油中AFB1 提取液的SERS 光谱，如图4 所示。花生油中AFB1 浓度为0.02 mg/kg 时，544 cm‒1处AFB1 拉曼特征峰值等满足3 倍空白标准差计算原则，因此确定本方法对花生油中AFB1 的检出限为0.02 mg/kg，可达到国家标准中AFB1 的检测限。

图4 不同浓度AFB1 提取液的SERS 光谱Fig.4 SERS spectra of different concentrations of AFB1 extracts

2.3 花生油中AFB1预测模型的建立

基于实验室自行搭建的表面增强拉曼光谱采集系统采集的原始光谱经SG 平滑和SNV 校正后的光谱如图5 所示，SG 平滑有效消除了光谱的随机噪声，SNV 校正消除了基线漂移对拉曼峰的影响。SG 平滑和SNV 校正后光谱再经ALS 校正消除了荧光基线背景，如图6 所示，544、691、1278 和1621 cm‒1处AFB1 的拉曼特征信号均随其浓度增加而增强，表明拉曼峰值与AFB1 浓度在一定范围内具有显著的正相关性。

图6 经SG 平滑、SNV 校正和非对称最小二乘（ALS）基线消除的SERS 光谱Fig.6 SERS spectra with SG smoothing,SNV correction and asymmetric least squares(ALS)baseline cancellation

基于联合x-y距离的样本集划分法（Sample set partitioning based on jointx-ydistance，SPXY）将预处理后的光谱与对应AFB1 的浓度分为校正集与预测集，划分比例为3∶1，分别建立了544、691、1278 和1621 cm‒1处AFB1 拉曼特征峰值与AFB1 浓度的一元线性回归（Unary linear regression）、多元线性回归（Multiple linear regression，MLR）和全光谱的PLSR 预测模型，结果见表1。544、691、1278 和1621 cm‒1处的AFB1 的拉曼特征峰值均与浓度具有较高的相关性，但依据单个拉曼特征峰的一元线性回归模型均方根误差相对较大。利用全光谱信息建立AFB1 的PLSR 定量预测模型显著优于544、691、1278 和1621 cm‒1处的一元线性回归和MLR 模型，其预测集决定系数R2p为0.9816，RMSEP 为0.04704 mg/kg。结果表明，AFB1 特征峰受溶液极性和基底变化的影响大。如前所述，AFB1 拉曼特征峰出现偏移，利用单一特征峰难以保障其定量检测的准确性，所以利用全光谱的PLSR 定量预测模型优势显著。

表1 一元线性回归、 MLR和PLSR模型性能比较Table 1 Comparison of performances of unary linear regression, MLR and PLSR models

全光谱中除包含AFB1 分子结构和官能团的指纹信息外，还包含其它多种无关变量，为进一步简化模型，分别利用CARS、RF 和SPA 算法筛选全光谱信息中AFB1 的特征变量，用于花生油中AFB1 定量PLSR 模型的构建。CARS 算法选择特征变量过程如图7 所示，根据RMSECV 最小原则，最终确定采样次数为43 次，AFB1 特征变量数为13 个。

图7 竞争性自适应重加权抽样（CARS）运行次数的影响Fig.7 Impact of the number of competitive adaptive reweighted (CARS) runs

分别通过CARS、RF 和SPA 算法筛选的AFB1 特征变量如图8 所示，3 种算法筛选的特征变量主要集中在图8D 中AFB1 标准储备液的表面增强拉曼特征位移544、691、1278、1307 和1623 cm‒1附近。CARS 算法筛选的特征变量除AFB1 拉曼特征峰宽的选择外，一些强度较弱的信号变化如454 和623 cm‒1处的拉曼峰也被识别。此外，300～400 cm‒1处的Ag—N 键的峰也被选择，表明分析物AFB1 与增强剂银溶胶的吸附作用与其浓度具有关联性[28]；479 和588 cm‒1基线处被选择，可能是因为校正后的光谱基线的变化能够间接反映分析物的浓度变化。

图8 （A）CARS、（B）随机蛙跳算法（RF）和（C）连续投影算法（SPA）3 种特征变量筛选算法确定的AFB1拉曼特征光谱变量；（D）AFB1 标准储备液的SERS 光谱Fig.8 Raman characteristic spectral variable of AFB1 determined by the three characteristic variable screening algorithms of CARS (A), random frog (RF) (B) and successive projections algorithm(SPA) (C); SERS spectrum of AFB1 standard stock solution (D)

分别基于CARS、RF 和SPA 3 种算法筛选的特征变量建立的花生油中AFB1 定量PLSR 预测模型的预测结果见表2。经变量筛选算法消除大量无关光谱信息后，基于CARS 算法所建立的模型效果最佳，其交叉验证集均方根误差RMSECV 仅为0.02566 mg/kg。综上，相比RF 和SPA 算法，CARS 算法更多地保留了AFB1 分子结构和官能团的指纹信息，有效消除了无关变量，提高了模型预测精度和稳定性。

表2 CARS-PLSR和RF-PLSR和SPA-PLSR模型性能比较Table 2 Comparison of performances of CARS-PLSR, RF-PLSR and SPA-PLSR models

2.4 花生油中AFB1快速检测系统外部验证

选取10 个未参与建模的花生油样品对CARS-PLS 定量预测模型进行外部验证。花生油中AFB1 含量预测值与理化值的决定系数（R2）为0.9792，均方根误差（RMSE）为0.04426 mg/kg，如图9 所示。结果表明，利用SERS 结合CARS-PLS 能够以较高的精度和准确性实现对花生油中AFB1 的快速检测。

图9 预测模型外部验证结果Fig.9 Predicting results of external validation of the model

3 结论

基于实验室自行研制的液态样品自动混匀表面增强拉曼光谱采集系统，利用QuEChERS 前处理技术，比较不同促凝剂对花生油中AFB1 SERS 特征信息的影响，确定1.2 mol/L KI 溶液作为促凝剂，获取了花生油中AFB1 的SERS 特征信号。同时，通过AFB1 标准储备液等SERS 光谱对比分析确定544、691、1278 和1621 cm‒1处拉曼峰为AFB1 的特征拉曼位移，分别建立了一元线性回归、MLR 和全光谱的PLSR 预测模型，其中利用全光谱的PLSR 定量预测模型优势显著。因AFB1 特征峰受溶液极性和基底变化的影响，AFB1 拉曼特征峰产生偏移，所以利用单一特征峰难以保障其定量检测的准确性。为有效消除无关变量，确保AFB1 分子结构和官能团的指纹信息，分别基于CARS、RF 和SPA 3 种算法筛选特征变量，建立AFB1 定量PLSR 预测模型，其中基于CARS 算法的模型效果最佳，其R2C为0.9961，RMSEC 为0.02213 mg/kg。对此模型进行了外部验证，其R2为0.9683，RMSE 为0.04426 mg/kg。研究结果表明，本方法检测过程简单、耗时较短，可以作为常规真菌毒素检测的补充方法，为粮油安全检测和市场监管提供了新思路。