尿液中生物硫醇的智能比色检测

张子缓 刘凤娇,2 郑凤英 骆嘉燚 黄昭景 梁洁玲郑静茵 黄倩燕 李顺兴*,2

1（闽南师范大学化学化工与环境学院， 漳州 363000）2（现代分离分析科学与技术福建省重点实验室， 污染监测与控制福建省高校重点实验室， 漳州 363000）

生物硫醇包括半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）等，在人体生理和病理过程中起着重要作用，其含量水平反映了人体内循环稳态。尿液中Cys 含量与癌症以及结石性胱氨酸尿有关[1]，Cys 浓度过高有罹患肝胱氨酸尿病风险[2]；尿液中Hcy 含量超出一定范围则可能与肾脏和血管疾病相关[3]；GSH 稳态的变化与神经退行性疾病、衰老、HIV 感染、囊性纤维化和癌症相关联，Hcy 参与很多生理过程[4-5]。因此，检测这些生物硫醇对于日常居家健康监测和疾病预诊具有重要意义。

目前，尿液中生物硫醇的测定方法包括高效液相色谱法[6]、荧光分光光度法[3,7-14]、电化学方法[1,15]、免疫法[16-17]和纸基微流控比色法[18]等。高效液相色谱法和荧光分光光度法需昂贵大型仪器，操作和携带不便，检测时间长；电化学方法检出限低，但不稳定；免疫法价格昂贵、操作检测复杂，不适合非专业人使用；纸基微流控比色法不稳定，测试误差大。传统比色法通常使用人眼识别和欧式距离（Euclidean distance，ED）法检测，易受人为因素影响和环境噪声干扰，待测样品的颜色特征易产生波动，即使同一样品的图像，不同位置色差也会很大，特别是边缘和中心色块均匀性不一致，这归因于不同人操作及样品渗透速度的差异性，材料不均匀性不可避免地导致光散射差异，引起测量结果变异。因此，亟需一种适合居家使用的成本低、检测快、易操作、精度好和准确率高的与生物硫醇相关的疾病预检方法。

采用静电纺丝技术制作的纳米纤维膜已被用于制作如智能垫子、催化支架、过滤膜、能量存储/传统组件、电气器件和生物医学支架等，在基于比色法的分析检测中取得了良好的效果[19]。机器学习的模型得益于全样本图像表征和强大的特征提取能力，可基于此优化比色传感器的检测精度和灵敏度，已经成功应用于溶解铁形态分析及生物利用性评价[20]和食品中的亚硝酸盐浓度的测定[21]等，用户使用时结合开发的智能手机APP，采用手机拍照，按照APP 页面提示操作即可获取测试结果[22]。Ortenzi 等[23]通过人工智能（卷积神经网络（Convolutional neural networks，CNN））算法，使用RGB 图像分析对奶牛粪便的主要特征如pH 值、颜色和一致性进行了分类和评估。

新型硫醇显色剂Zincon-Zn2+络合物对巯基有特异性响应，其络合平衡常数（K=1.01×107）远小于巯基-Zn2+络合物（K=4.10×1011）。当存在硫醇时，Zincon-Zn2+会发生Zn2+的解离与络合反应，因此可根据试纸颜色变化来定量分析尿液中的生物硫醇含量[24-25]。本研究以聚丙烯腈（Polyacrylonitrile，PAN）、薄层层析硅胶（Silica gel，SG）和聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl pyrrolidone，PVP）为载体，采用静电纺丝技术将显色剂均匀嵌进纳米纤维膜中，采用比色法检测生物硫醇，并与CNN 结合，构建了生物硫醇全分析系统，具有准确率高、检出限低、使用期限长和简易便携等特点，可用于疾病的无创预诊。

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

LN-01C 静电纺丝仪（绿纳科技有限责任公司）；Zeiss Sigma 300 扫描电子显微镜（德国卡尔蔡司公司）；IJ-6B 磁力搅拌器（金坛市新航仪器厂）；UV-5800PC 紫外-可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；BS 124S 电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；带平面标准光源（定制）。

PAN（分子量150000，美国Sigma-Aldrich 公司）；Zincon 试剂（麦克林生化科技股份有限公司）；N,N-二甲基甲酰胺（D M F， 9 9.5%）、P V P（分子量1 3 0 0 0 0）、S G（9 9%）、二水合醋酸锌（C4H6O4Zn·2H2O，99%）、蛋氨酸（Met，99%）、丙氨酸（Ala，99%）、色氨酸（Trp，99%）、高半胱氨酸（Hcy，99%）、精氨酸（Arg，98%）、酪氨酸（Tyr，99%）、异亮氨酸（Ile，99%）、尿素（Ure，99%）、缬氨酸（Val，99%）、苯丙氨酸（Phe，99%）、丝氨酸（Ser，99%）、甘氨酸（Gly，99%）、L-半胱氨酸（Cys，95%）、苏氨酸（Thr，99%）、组氨酸（His，99%）、亮氨酸（Leu，99%）、赖氨酸（Lys，99%）、脯氨酸（Pro，99%）和谷胱甘肽（GSH，98%）（阿拉丁生化科技有限公司）。所用试剂均为分析纯；实验用水为超纯水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 实验方法

1.2.1 静电纺丝法制备生物硫醇比色试纸

生物硫醇比色试纸的制备过程如图1A 所示。称取20 mg Zincon 试剂和8.0 mg 二水合醋酸锌溶解于6.0 mL DMF 中，加入0.40 g PAN、0.10 g PVP 和0.15 g SG，常温（25 ℃）下搅拌8.0 h， 移入10 mL 注射器中。设置静电纺丝仪注射泵速度、滚筒转速、正负极电压和注射器流速分别为1.5 mL/h、60 r/min、17 kV和1.7 mL/h， 在环境湿度低于60%和25 ℃的条件下进行静电纺丝。4 h 后得到均匀的高分子纳米纤维膜，经真空烘箱烘干3 h，即得到生物硫醇比色可视化试纸（PAN-Zincon-Zn2+），将其裁剪成1.0 cm×1.0 cm的正方形。

图1 （A）静电纺丝法制备PAN-Zincon-Zn2+比色试纸示意图；（B）PAN-Zincon-Zn2+比色试纸检测机理图Fig.1 (A) Schematic illustration of preparation of PAN-Zincon-Zn2+ colorimetric paper by electrospinning method; (B) Schematic of detection mechanism of PAN-Zincon-Zn2+ colorimetric test paper

如图1B 所示，Zincon 指示剂和生物硫醇的巯基存在对Zn2+的竞争性结合。当生物硫醇不存在时，Zn2+可形成Zincon-Zn2+配合物，试纸呈蓝色；当生物硫醇存在时，其巯基与Zincon-Zn2+解离出来的Zn2+络合，试纸颜色由蓝色逐渐变为紫红色。

1.2.2 人工尿液的配制

分别称取17.3 g Ure、14.1 g NaCl、2.80 g KCl、0.600 g CaCl2·2H2O、0.430 g MgSO4·4H2O 和0.500 g NH4OH，溶于1.0 L 超纯水中，加入0.62 mL HCl，制得人工尿液（pH = 7.0±0.1）。

1.2.3 数据集的制备

以Cys 为代表，分别以超纯水、人工尿液和健康人尿液为溶剂，Cys 为溶质，配制浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 和30 mmol/L 的溶液。

分别取上述制备的不同浓度溶液10 μL 滴在试纸（见1.2.1 节）中心，10 s 后，采用平面标准光源（R=10，G=10，B=10），试纸距摄像头10 cm 处，利用机器视觉连续捕捉每个浓度的图像，其中，超纯水溶液样品图片2100 张，人工尿液样本图片700 张，健康人尿液样本图片1400 张。将这4200 张图片混在一起，相同浓度的打上标签（例如1.0 mmol/L 的图片标签为1.0），按浓度进行样本分类，形成全浓度数据集。

1.2.4 生物硫醇智能比色检测系统的构建

如图2 中①所示，本研究应用的机器学习模型是基于CNN 算法，通过卷积和池化运算，提取PANZincon-Zn2+的特征。

图2 基于卷积神经网络（CNN）模型比色分析系统的生物硫醇快速定量检测示意图Fig.2 Schematic diagram of rapid and quantitative detection of biomercaptan by convolutional neural networks(CNN) model-based colorimetric analysis system

如图2 中②所示，将数据集（见1.2.3 节）按8∶2 分成训练集与验证集（训练集3360 张，验证集840 张），通过调节后台代码参数训练出合适的机器学习模型，用PyQt5 完成界面，后台点击上传图片按钮，即对图像浓度进行预测，后台返回生物硫醇浓度。

如图2 中③所示，采用github 开源Tensorflow 2.3 框架搭建CNN 和轻量化卷积神经网络（Mobilenet）两种模型，对数据集进行分类，据图片样本分类正确率对代码模型和参数进行适当调整，训练出精确度符合实际要求的模型，通过上传真实样本检测模型的正确率和损失函数。这两种模型由卷积层、最大池化层和全连接层组成，分别用于图像特征提取、降维（减少计算数据量）和分类。以划分好的测试集输入模型进行训练，训练后的模型可从比色试纸中提取显色特征，根据图像特征将其归为某一浓度，从而进行定量分析。采用安卓技术开发APP，用智能手机捕捉图像上传，封装好的机器学习模型处理并给出测量浓度。

1.2.5 试纸的亲水性测试

采用接触角计测量水接触角（Water contact angle，WCA）。测量前，将纳米纤维垫切成20 mm×40 mm大小，粘贴在载玻片上。将载玻片水平放置，将5 μL 超纯水滴在膜表面，在10 s 内测量薄膜表面与水滴之间的接触角并拍照。对每个纳米纤维薄膜样品进行3 次重复实验。WCA 可以准确地反映纳米纤维薄膜的表面疏水性，WCA ＞90°的表面视为疏水表面。

2 结果与讨论

2.1 比色试纸表征

PAN 作为比色试纸基底，不溶于水，以纤维丝方式层层堆积包裹、保护内部的显色剂Zincon-Zn2+，可以延长PAN-Zincon-Zn2+比色试纸保质期。PVP 稳定无毒，含强极性基团内酰胺，具有吸水性，还有增溶、分散和吸附效应。将水溶性高分子聚合物PVP 加入到静电纺丝液中，可使比色试纸具有亲水性，受试样品更易渗进试纸，显色反应更容易、更快[23]；但由于反应迅速，显色不均匀，都发生在试纸边缘。加入不溶于有机溶剂的SG，通过剧烈搅拌（＞1400 r/min）使之均匀分散在纺丝液中，SG 表面有大量羟基，具有亲水性，这样制作出来的比色试纸显色均匀。如图3A 所示，显色剂均匀包裹在比色试纸中每一条纳米纤维丝中，而且比色试纸具有“鸟巢状”的结构，增加了比表面积。如图3B 所示，随机选取50 根纳米纤维丝测量直径，70%纳米纤维丝的直径在300～350 nm 之间。对比色试纸的亲水性能进行探究发现，只加入PAN，动态接触角大于120°，试纸疏水性好，从液滴开始接触并完全润湿试纸时间约为16 s（见电子版文后支持信息）。当加入SG 和PVP 后，液滴接触试纸时间0、3 和4 s，动态接触角分别为α=121°（图3C）、β= 61.2°（图3D）和θ= 29.9°（图3E），完全润湿需要8 s， 测试时间比只加PAN 减少1/2，可见加入PVP 和SG 提高了试纸的亲水性。

图3 （A、B）PAN-Zincon-Zn2+比色试纸不同放大倍数的扫描电镜（SEM）图像，图B 中插图为粒径分布图；PAN-Zincon-Zn2+比色试纸在滴加超纯水（C）0、（D）3 和（E）4 s 时的水接触角（WCA）Fig.3 (A,B)Scanning electron microscopy(SEM)images of PAN-Zincon-Zn2+colorimetric paper with different magnifications,inset in Fig.3B is diagram of size distribution;Water contact angles(WLA)of PAN-Zincon-Zn2+colorimetric test paper after dropping ultrapure water for (C) 0, (D) 3 and (E) 4 s, respectively

2.2 比色试纸性能测试

取1.2.3 节配制的不同浓度的Cys 溶液各10 μL， 由低浓度到高浓度顺序滴加在PAN-Zincon-Zn2+试纸中心，10 s 后得到一个标准比色卡，随Cys 浓度由低到高，试纸呈现由蓝色、紫红色到酱红色变化顺序。将比色卡图像导入Photoshop 进行分析，读取试纸的B 值（B-valve），发现随着Cys 浓度升高，B 值呈现下降趋势（0～10 mmol/L）， 随后趋于稳定（10～30 mmol/L）（图4A），Cys 浓度在0～10 mmol/L 范围内与B 值呈线性负相关（图4B）。这是传统的ED 法，线性范围为0.5～10 mmol/L。在Cys 浓度超过10 mmol/L时，肉眼已不能辨别出PAN-Zincon-Zn2+试纸颜色的细微变化。

图4 （A）欧氏距离（ED）法中不同浓度Cys 对应的B-value；（B）ED 法中Cys 浓度与B-value 的线性拟合结果；（C）Zincon、Cys 与Zn2+络合反应吸收光谱图，插图为对应的光学照片; （D）基于CNN 模型的智能比色检测标准曲线图; （E）常见氨基酸（Cys、Hcy 和GSH: 1.00 mmol/L; 其它氨基酸2.00 mmol/L）干扰性实验图Fig.4 (A) B-values of different concentrations of Cys in Euclidean distance (ED) method; (B) Linear fitting of Cys concentration and B-value in ED method; (C) Absorption spectra of Zincon and Cys complexing with Zn2+,inset is corresponding optical images;(D) Standard calibration curve of intelligent colorimetric detection based on CNN model; (E) Interferences of common amino acids (Cys, Hcy, GSH: 1.00 mmol/L; other amino acids:2.00 mmol/L)

本研究探究了在水溶液中主要存在的3 种物质Zincon、Zn2+、Cys 及其络合物的整个体系的紫外-可见吸收光谱变化，如图4C 曲线a 所示（由15.0 mmol/L Zincon 与7.5 mmol/L Zn2+络合为Zincon-Zn2+，取0.5 mL 加入到3.0 mL 超纯水中），Zincon-Zn2+呈蓝色，最大吸收波长为638 nm；如图4C 曲线b 所示（将曲线a 中的超纯水换为等体积的3.0 mmol/L Cys），Cys-Zn2+与Zincon-Zn2+共同存在，是红色和蓝色的混合色；如图4C 曲线c 所示（0.5 mL 15.0 mmol/L Zincon 加入3.0 mL 超纯水），只有Zincon 存在时，溶液呈现橙红色，最大吸收峰波长为462 nm；如图4C 曲线d 所示（0.5 mL 7.5 mmol/L Zn2+与2.5 mL 3.0 mmol/L Cys络合），Cys-Zn2+无色透明。鉴于Zincon-Zn2+对400～750 nm 光均有吸收，与比色测定Cys 后置换出的Zincon 存在明显的光谱干扰，常用的紫外-可见分光光度法无法准确定量分析Cys。

综上可知，ED 法无法辨别相似图像细微的区别，紫外-可见分光光度法受整个体系复杂反应的影响，两种方法都不能精确定量分析Cys。本研究开发了基于CNN 算法的模型，如图4D 所示，通过卷积计算提取图像特征，池化去掉噪声，采用有监督的方法把样本和标签输入模型，得到一个真实样本和预测样本标签的标准曲线，即CNN 模型预测的Cys 浓度与其真实的浓度呈正相关。基于CNN 模型测定Cys 浓度的检出限为0.01 mmol/L， 线性范围由ED 法的0.5～10 mmol/L 扩展到了0.01～30 mmol/L。

为了评估方案的可行性，本研究选取了尿液中可能存在的氨基酸进行抗干扰实验，如图4E 所示，不含巯基的氨基酸对测定结果无显著影响，即PAN-Zincon-Zn2+比色试纸对含巯基氨基酸的测定具有选择性。

2.3 人工智能模型优化

将训练集和验证集分别采用CNN 和Mobilenet 两种模型，经加载数据集、加载模型、保存模型和测试模型提取图片特征，训练200 次以测试效果。如图5A 和5B 所示，CNN 模型训练65 次时，训练集和验证集的准确率已达到1，损失函数随训练次数增加和模型正确率同步收敛，当正确率达到1 时，损失函数值收敛到0.1，说明模型学习能力好。Mobilenet 模型在训练55 次时，正确率达到1，此时损失函数值收敛到0.1，显示训练集效果好（图5C）。采用验证集验证Mobilenet 模型的准确率，根据结果去调节模型参数，增强模型泛化能力和鲁棒性，由图5D 可得，当训练次数少于55 次，损失函数在0.5 处收敛，验证集正确率在55%～65%之间波动，说明损失函数出现梯度爆炸现象。即使将训练集模型中的学习率降低，增大训练轮数，验证集正确率可上升到75%，损失函数也只能降到0.2，因此Mobilenet 模型训练存在过拟合问题，对图像样本学习效果较差，优化不到理想效果。因此，CNN 模型可以根据图像更准确预测样本浓度。

图5 （A）CNN 训练精度、损失值与训练次数拟合曲线；（B）CNN 验证精度、损失值与训练次数的拟合曲线；（C）轻量化卷积神经网络（Mobilenet）训练精度、损失值与训练次数的拟合曲线；（D）Mobilenet验证精度、损失值与训练次数的拟合曲线Fig.5 (A) Fitting curve of training accuracy, loss value and training times by CNN; (B) Fitting curve of verification accuracy,loss value and training times by CNN;(C)Fitting curve of training accuracy and loss value with training times by Mobilenet;(D)Fitting curves of accuracy and loss value with training times by Mobilenet

制备2.0 mL Cys 浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 和30 mmol/L 的人工尿液，每个浓度测定10 次，各制作10 张图片，对模型准确率进行测试。抽取每个浓度图片各1 张进行测试，模型对输入样本的评价与真实标签对比后进行打分，将最接近真实标签的概率判定为最可能的值，判断结果概率最大的作为预测标签返回给用户。CNN 模型预测上述浓度真实概率分别为0.81、0.80、0.70、0.82、0.90、0.65、1.00 和0.91，判断为其它非真实标签的概率均小于0.35，模型返回用户数据是概率最大的对应浓度，所以这些待测样本的准确率为1（图6A）。将剩下72 张样本图片输入模型进行验证，70 张预测正确，2 张预测错误，即样本预测正确概率为97.5%。采用相同测试集和方法对Mobilenet 模型的准确率进行评估，随机抽取每个浓度图片各1 张进行测试，Mobilenet 模型输出预测的真实概率分别为0.50、0.60、0.70、1.00、0.60、0.20、0.90 和0.75，真实样本为0 mmol/L 的标签判断为0 mmol/L 或0.5 mmol/L 的概率都为0.50，模型会给用户返回2 个预测值。真实样本为10 mmol/L 的判断正确概率为0.20，判断错误概率为0.80，此时返回用户的浓度是30 mmol/L，模型将标签为10 mmol/L 的样本判断错误（图6B）。剩下72 张样本图片输入模型进行验证，58 张正确，14 张错误，Mobilenet 模型预测正确概率为80%。经过1000 张样本验证，CNN 模型正确率稳定在98%，Mobilenet 模型正确率平均约75%，且不稳定，而传统ED法准确率为85%（图6C）。综上，建立的CNN 模型稳定性和准确率更好。

图6 （A）CNN 模型真实值和预测值的热图；（B）Mobilenet 模型真实值和预测值的热图；（C）ED 法、CNN 模型法和Mobilenet 模型法正确率对比图Fig.6 (A)Heat map of true and predicted values with CNN model;(B)Heat maps of real and predicted values with Mobilenet model; (C) Accuracy comparison among ED method, CNN model and Mobilenet model

2.4 实际样品分析

为验证基于CNN 的智能可视化检测平台对尿液中生物硫醇检测的准确性，取健康人的尿液（取自课题组志愿者）10.0 mL，用0.22 μm 滤膜过滤，以Cys 为生物硫醇代表物质，进行加标回收实验，结果见表1。?回收率在98.4%～114.0%之间，相对标准偏差（RSD）为1.6%～3.0%，表明基于CNN 的方法用于实际尿液中生物硫醇的检测具有良好的实用性。

表1 基于CNN模型的人尿液中生物硫醇检测结果Table 1 Detection results of biomercaptan in human urine based on CNN model

3 结论

本研究基于竞争性、选择性和快速络合反应前后吸光性能的显著差异，设计了新型生物硫醇显色剂Zincon-Zn2+，以PNA、SG 和PVP 为保护载体，采用静电纺丝技术，构建了稳定性、重现性、选择性和抗干扰性能优良的比色传感器。将CNN 模型与比色试纸结合，借助机器学习突出的全样本图像表征和强大的特征提取能力，以B 值为测量参数，有效解决了Zincon-Zn2+与Zincon 严重的光谱干扰问题，可以快速测量尿液中生物硫醇的浓度。结果表明，采用CNN 模型准确率可达98%以上，检出限为0.1 mmol/L；将训练好的卷积云网络模型封装，通过与手机APP 结合，提高了使用便捷性。