肌肽对糖尿病肾病大鼠肾组织AKT/mTOR通路及自噬的影响

任 毅，卢金莹，于露，李宗泽，王高，杨菁

锦州医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，辽宁 锦州121001

糖尿病肾脏疾病（DKD）是糖尿病的常见并发症，其发病人数占全球糖尿病患者的20%～40%［1］，已成为终末期肾病的第一病因［2,3］。DKD患者在中国的住院率从2010年的3.58%上升到2017年的4.95%，上升趋势明显［4］，同时DKD患者发生不良心血管病、感染和死亡的风险明显升高，给患者及家庭带来巨大经济和精神压力［5］。DKD发病机制十分复杂，现研究主要聚焦在氧化应激、炎症和自噬等方面［3,6］。DKD治疗方法有限，主要通过控制血压和血糖，降低白蛋白尿来延缓DKD的进展，但效果并不理想［7-9］。因此广泛探索DKD发病机制，并在此基础上开展相关药物研究显得尤为迫切［8-10］。

肌肽是一种天然的、广泛存在于各种脏器的水溶性内源性二肽，具有抗氧化应激、抗炎、抑制蛋白质非酶糖基化等诸多生理功能［11-13］。本团队前期研究表明，肌肽对DKD大鼠具有保护作用，其机制可能与其抑制氧化应激和NF-κB 信号通路异常激活有关［14］。但肌肽对DKD大鼠Akt/mTOR信号通路及自噬的影响却未见报道。本实验利用高糖高脂饲料喂养结合STZ腹腔注射制备糖尿病（DM）大鼠模型，通过观察大鼠的体质量和血糖的变化，比较血肌酐（Scr）、尿蛋白、24 h尿量及组织学变化，探讨肌肽对DKD的保护作用，同时进一步观察肾脏组织中AKT、mTOR、LC3、p62蛋白表达的趋势变化，探讨肌肽的作用机制，为DKD的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

70只健康雄性SD大鼠，体质量150～160 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司。实验动物合格证号：SCXK(辽)2020-0001。动物饲养室温度22±2 ℃，湿度（55±2）%。动物实验通过锦州医科大学伦理学审批（No.2022032101）。

1.2 主要试剂和仪器

肌肽，纯度99.9%以上（苏州富士莱医药）；高糖高脂饲料、普通饲料（北京博爱港生物技术）；链脲佐菌素（Sigma）；Akt、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3、p62、βactin抗体（武汉爱博泰克生物科技）；HE染色试剂盒、SOD、MDA试剂盒、BCA试剂盒（北京索莱宝科技）；肌酐和尿蛋白定量试剂盒（南京建成生物）。显影液、RIPA裂解液（沈阳万类生物）；快速制胶试剂盒（苏州新赛美生物科技）。倒置显微镜（Olympus）；石蜡切片机，德国莱卡；电泳仪、凝胶成像仪、转膜机（Bio-Rad）。MK3酶标分析仪（上海赛默飞世尔）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组和大鼠DM模型建立 将70只大鼠适应性喂养1周后随机分为对照组（CON，n=14）和高糖高脂组（n=56）。CON组普通饲料喂养，高糖高脂组高糖高脂饲料喂养。高糖高脂喂养4周后禁食不禁水12 h，一次性注射30 mg/kg STZ，72 h后Onetouch血糖仪测血糖，共有51只大鼠血糖≥16.7 mmol/L，视为造模成功。将造模成功大鼠随机进一步分为DM组（n=12只）及肌肽低（Car-L，n=13）、中（Car-M，n=13）、高剂量组（Car-H，n=13），各组分别按照每日0 mg/kg、100 mg/kg、300 mg/kg和900 mg/kg肌肽灌胃，各组依然高糖高脂饲料喂养继续喂养12周直到取材。

1.3.2 样本采集 饲养大鼠期间，7 d/次测定体质量，定期测量血糖值。实验结束前，收集24 h尿液。收集血清后，处死大鼠后取肾脏，一侧肾脏储存于-80℃冰箱中，另一侧肾脏擦干水分放入10%多聚甲醛中进行固定。

1.3.3 血肌酐（Scr）、24 h尿蛋白含量测定 随机取8个样品，采用肌氨酸氧化酶法测定血肌酐。CBB法，测定尿蛋白。具体按试剂盒说明书操作。

1.3.4 HE染色检测大鼠肾脏组织病理形态变化 将浸泡在4%多聚甲醛中进行固定的肾组织取出，经过脱水、二甲苯透明后进行液体石蜡包埋，等待石蜡冷却至室温后进行修剪蜡块、制作切片，石蜡切片厚度约为4 μm。将准备进行染色的蜡块进行二甲苯常规脱蜡和梯度酒精水化后，进行染色。染色后的切片经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜观察并拍照。

1.3.5 试剂盒检测大鼠肾脏组织SOD、MDA 严格按照说明书操作，随机取冻存8个肾脏组织，破碎后取上清液，记录实验数据；将数据按照公式进行计算，检测大鼠肾脏组织SOD活性、MDA含量。

1.3.6 Western blot 检测大鼠肾脏组织中T-AKT、p-AKT、T-mTOR、p-mTOR、p62、LC3蛋白的表达 取冻存肾脏组织，提取蛋白，测定浓度，经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭后分别用T-AKT、p-AKT、T-mTOR、pmTOR、p62、LC3、β-actin抗体孵育过夜，洗膜后加入二抗，ECL成像。Image J 软件分析并计算相应的蛋白条带与β-actin的灰度比值。

1.4 统计学处理

运用SPSS 20.0软件对数据进行处理，实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肌肽对DM大鼠状态、血糖和体质量的影响

实验结果显示，与CON组相比，DM组大鼠的反应较为迟钝、不喜运动、弓背卷体、多饮多尿明显、毛色发黄光泽差。与DM组相比，Car各组大鼠毛发清洁程度有改善，精神状态恢复。与CON组相比，DM组注射STZ后血糖水平显著升高，体质量显著降低，该趋势一直维持到实验结束，差异有统计学意义（P＜0.01）。与DM组相比，Car各组血糖略有下降，体质量升高，但只有Car-H组体质量具有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 肌肽对DM大鼠血糖和体质量的影响Fig.1 Effects of carnosine on blood glucose and body weight of the diabetic rats(Mean±SD,n=12-14).##P＜0.01 vs CON group;*P＜0.05 vs DM group.

2.2 肌肽对DM大鼠Scr、尿蛋白、24h尿量和肾脏质量的影响

与CON 组相比，DM 组的大鼠Scr、尿蛋白含量、24 h尿量和肾脏质量均有所升高（P＜0.01）。与DM组相比，CAR-M和Car-H组大鼠的尿蛋白含量、24 h尿量均显著降低（P＜0.05），肾脏质量与Scr下降有下降趋势，但差异无统计学意义（图2）。

图2 肌肽对DM大鼠的生理指标的影响Fig.2 Effect of carnosine on renal indexes of DM rats(Mean±SD,n=8-14).##P＜0.01 vs CON group;**P＜0.01 vs DM group.

2.3 肌肽对DM大鼠肾脏组织形态的影响

CON组大鼠肾脏细胞均匀分布，肾小球形态圆润饱满，肾小管结构正常，基底膜系膜形态规则无增生。DM组大鼠肾脏组织细胞紊乱，肾小球肿胀变形，形状不规则，伴随基底膜增厚，系膜增生，肾小管出现狭窄现象。CAR组肾小球内系膜增生和基底膜增厚程度略有降低，肾小球形状逐渐圆润规整，空泡状肾小管上皮细胞有所恢复，尤其以高浓度组效果更佳（图3）。

图3 各组大鼠的肾脏HE染色结果Fig.3 HE staining of renal tissue in each group(Original magnification:×400).A:CON group.B:DM group.C:Car-L group.D:Car-M group.E:Car-H group.

2.4 肌肽对DM大鼠肾脏组织SOD和MDA的影响

与CON组相比，DM组的大鼠的肾脏组织SOD活性下降，MDA含量上升（P＜0.05）。与DM组相比，Car各组大鼠肾脏组织中的SOD含量上升，MDA含量下降（P＜0.05），并且呈现剂量依赖性（图4）。

图4 肌肽对DM大鼠肾脏中氧化应激的影响Fig.4 Effect of carnosine on SOD activity and MDA content in the kidney of the rats with DM.##P＜0.01 vs CON group;**P＜0.01 vs DM group.

2.5 肌肽对DM大鼠肾脏组织AKT、mTOR、P-AKT、pmTOR、LC3 I、LC3 II、p62的影响

与CON组相比较，DM组的大鼠肾脏组织中AKT和mTOR 蛋白总量无明显差异，但p-AKT/AKT、pmTOR/mTOR的比值明显降低（P＜0.05），p62蛋白表达及LC3-II/LC3-I比值明显升高（P＜0.01）。与DM组进行比较，Car各组p-AKT/AKT与p-mTOR/mTOR比值均有所上升，p62蛋白表达及LC3-II/LC3-I比值均下降，尤其以Car-M和Car-H组更明显（P＜0.01，图5）。

图5 Western blot检测AKT、mTOR、P-AKT、p-mTOR、LC3、p62蛋白的表达水平Fig.5 Renal expression of AKT,mTOR,P-AKT,LC3,and p62 proteins in the rats detected by Western blotting.A:Representative image of AKT,mTOR,P-AKT,LC3,p62 proteins detected by Western blots.B:The ratio of p-AKT/AKT protein expression.C:The ratio of p-mTOR/mTOR protein expression.D: The ratio of LC3 II/I protein expression.E: Relative expressions of P62 protein.##P＜0.01 vs CON group;**P＜0.01 vs DM group.

3 讨论

DKD是目前糖尿病最为常见也是最为严重的一种慢性微血管并发症，30%～40%的糖尿病患者会发展成DKD。采用高糖高脂饲养同时配合STZ腹腔注射建立了DM大鼠模型，实验结果表明，与CON组相比较，DM组的大鼠体质量明显的减轻（P＜0.05）、血糖、Scr、尿蛋白及24 h尿量升高明显（P＜0.05），肾小球出现基底膜增生、系膜增厚和肾小球肿胀变形等，说明DKD模型制备成功，与文献报道一致［15］。与DM组相比，肌肽各组可见以上各指标不同程度的减轻，其中肌肽高剂量组的效果最为明显，说明肌肽对DM肾脏病变具有保护作用。

血糖升高可产生过量自由基，同时清除能力下降，其导致的氧化应激失衡在DKD 中起重要作用［16,17］。SOD的主要功能是清除体内产生的氧自由基。MDA是脂质发生过氧化反应最终产物，其含量可以反映机体过氧化的程度，是常用的过氧化损伤的指标。实验结果显示，与CON组相比，DM组的大鼠血清中SOD活性下降，MDA含量上升，说明DM组大鼠氧化应激损伤明显。灌胃肌肽后，肌肽提高DM组大鼠SOD活性及降低MDA含量，因此推断肌肽可通过提升大鼠机体的抗氧化能力，从而对DM肾脏病变产生保护作用。

氧化应激与AKT/mTOR 途径密切相关［18,19］，而AKT/mTOR 途径又在DKD 中发挥重要作用［20,21］。AKT的苏氨酸和丝氨酸残基发生磷酸化后，直接或间接通过结节性硬化复合体激活mTOR 蛋白，调节下游效应分子S6K1 和4E-BP1的表达，从而调节细胞的增殖、分化、凋亡和自噬等生理活动［18,22］。在肾脏中，mTOR活性的生理水平是支持肾细胞生长和分化、维持肾细胞完整性和正常肾单位功能，包括电解质、水和葡萄糖的运输所必需的，其活性失调会导致肾脏疾病［21］。结果显示，与CON 组相比，DM 组p-AKT/AKT 和pmTOR/mTOR比值降低，与文献结果一致［23］。同时也应该注意到不同种属、模型制备方法和时间不同的DM模型，p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值的变化趋势并不一致［24,25］，具体原因仍需进一步研究。灌胃肌肽后p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值升高，而以高浓度肌肽效果更明显，推测肌肽可通过激活AKT/mTOR途径发挥其保护作用。

Akt/mTOR信号通路对自噬过程具有重要调节作用［26,27］，可以抑制自噬体的合成［28,29］。自噬是一种高度保守的溶酶体降解途径，对于维持细胞的稳态发挥重要作用［30］，其调节失控在DKD的进展中起着重要作用［6,31,32］。微管相关轻链蛋白3（LC3）是一种可溶性蛋白质，通过对其C末端切割产生LC3-I，进一步与磷脂酰乙醇胺结合产生LC3-II。LC3-II反映细胞自噬体相对数量，可作为自噬活性和DKD 进展的标志物［33］。P62是自噬受体蛋白，与可作为自噬降解指标，与自噬活性呈负相关。本实验结果显示，与CON组相比，DM组p62蛋白表达及LC3-II/I比值明显均明显升高（P＜0.05），而肌肽灌胃后，随着肌肽浓度增加，p62蛋白表达及LC3-II/I比值逐渐降低，以上结果说明DM大鼠肾脏自噬过程受到干扰，而肌肽可以调节DM大鼠自噬恢复正常。

综上所述，肌肽可通过激活AKT/mTOR 信号通路，改善自噬发挥对DM肾脏病变的保护作用。