五加皮中二萜类化学成分及其抗炎活性研究

张 雪 ，解盈盈，刘 琦，关永霞，赵淑秀，刘青芝，林永强，郭东晓 ∗

1.山东省食品药品检验研究院，国家药监局胶类产品质量评价重点实验室，山东省中药标准创新与质量评价工程实验室，中药配方颗粒共性技术山东省工程研究中心，山东 济南 250101

2.山东现代学院，山东 济南 250104

3.经方与现代中药融合创新全国重点实验室，山东 临沂 276006

4.山东中医药大学，山东 济南 250355

五加皮为五加科五加属植物细柱五加AcanthopanaxgracilistylusW.W.Smith.的干燥根皮，又称南五加皮、五谷皮、红五加皮，主要分布于我国湖北、河南、陕西、安徽、浙江、辽宁、河北等省，为临床常用的传统中药材[1]。五加皮始载于《本经》，主要功效为祛风除湿、补益肝肾、强筋壮骨、利水消肿，临床上主要用于治疗风湿痹病、筋骨萎软、小儿行迟、体虚泛力、水肿和脚气等疾病[2]。《中华本草》[3]中记载五加皮具有抗炎镇痛、抗应激、抗肿瘤、提高免疫力等作用，其化学成分主要有挥发油类、萜类、甾醇类、有机酸类、脂肪酸类、苯丙素类、黄酮类等[4]。现代药理学研究表明，五加皮具有很好的抗炎活性[5-6]。

本研究从五加皮70%乙醇提取物中分离得到13 个二萜类化合物，包括7 个海松烷型二萜7β-羟基-8(14),15-二烯-19-异海松烷酸 [7β-hydroxy-entpimara-8(14),15-dien-19-oic acid，1]、7- 酮基-8(14),15-二烯-19-异海松烷酸 [7-oxo-ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid，2]、7β-甲氧基-8(14),15-二烯-19-异海松烷酸 [7β-methoxy-ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid，3]、6,8(14),15-三烯-19-异海松羧酸[ent-pimara-6,8(14),15-trien-19-oic acid，4]、14-酮基-8,15-二烯-19-异海松羧酸（14-oxo-ent-pimara-8,15-dien-19-oic acid，7）、14-羟基-16-乙烯基-8,11,13-三烯-17-异海松羧酸（14-hydroxy-16-devinyl-entpimara-8,11,13-trien-17-oic acid，8）、7α-羟基-8(14),15-二烯-19-异海松烷酸[7α-hydroxy-entpimara-8(14),15-dien-19-oic acid，11]；以及6 个贝壳杉烷型二萜16α,17-二羟基-19-异贝壳杉烷羧酸（16α,17-dihydroxy-ent-kaur-19-oic acid，5）、17-羟基-19-异贝壳杉烷羧酸（17-hydroxy-ent-kaur-19-oic acid，6）、异贝壳杉烯酸（ent-kaur-16-en-19-oic acid，9）、17-醛基-19-异贝壳杉烯酸（17-oxo-ent-kaur-19-oic acid，10）、17-醛基-15-烯-19-异贝壳杉烷酸（17-oxo-ent-kaur-15-en-19-oic acid，12）和17-羟基-15-烯-19-异贝壳杉烷酸（17-hydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid，13）。其中化合物8 为新化合物，命名为细柱五加酸G1，3 和4 为首次从细柱五加植物中分离得到。采用Griess 法测试脂多糖诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 细胞释放炎症因子模型，对分离得到的化合物进行了抗炎活性评价。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

Bruker Avance Ⅲ 600 核磁共振波谱仪，德国布鲁克公司；METTLER TOLEDO XSE205 型电子天平，瑞士梅特勒托利多公司；Buchi R210 型旋转蒸发仪，瑞士步奇公司；Agilent 1200 型HPLC 色谱仪，美国安捷伦公司；HPLC-IT-TOF-MS 液质联用仪，日本岛津公司；Bio Tek EPOCH2NS 酶标仪，美国博腾公司。

乙醚、正丁醇、醋酸乙酯、甲醇、乙醇、石油醚、丙酮、二氯甲烷等试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；MCI GEL CHP20P（37～75 μm），日本三菱化学株式会社；柱色谱硅胶（200～300 目），青岛海湾精细化工有限公司；Sephadex LH-20，北京索莱宝科技有限公司；硅胶薄层板，烟台市化学工业研究所；HPLC 色谱柱，SymmentryShiedTMRP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；MTT 溶液，北京鼎国昌盛生物技术有限公司；（Eagle）DMEM 高糖培养基，美国Gibco 公司；胎牛血清，上海达特希尔生物科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO），Life Science 公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；对氨基苯磺酰胺，北京鼎国昌盛生物技术有限公司；胰酶，北京鼎国昌盛生物技术有限公司；3,4-二羟基苯甲羟肟酸（DiDOX），美国MedChem Express 公司，批号HY-19387/CS-5292；小鼠巨噬细胞RAW264.7，美国菌种保藏中心（ATCC）；NO 试剂盒，上海酶联生物科技有限公司。

1.2 材料

五加皮产地为湖北，经山东省食品药品检验研究院穆向荣副主任药师鉴定为五加科五加属植物细柱五加A.gracilistylusW.W.Smith.的干燥根皮，样品（SDIFDC-G-AGZ01）保存于山东省食品药品检验研究院。

2 方法

2.1 提取与分离

取五加皮药材4 kg，粉碎，以70%乙醇为溶剂，加热回流提取3 次，每次1 h，合并提取液，减压回收溶剂，得到粗提物浸膏600 g。将粗提物用适量温水分散，用乙醚萃取3 次，合并萃取液，减压浓缩得乙醚层浸膏130.2 g。将乙醚层浸膏溶解后经MCI树脂柱分离，用甲醇-水溶液（40%～100%）梯度洗脱，共得到7 个流分。流分4 用硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮系统（100∶1～1∶1）进行梯度洗脱，经TLC 检测并合并相同组分，得到Fr.4A～4U 共21个组分。组分4L 经结晶得到化合物1（60 mg），经硅胶柱（石油醚-丙酮19∶5～17∶1）分离，结晶得到化合物4（2.0 mg）；组分4J 和4D 经结晶分别得到2（32 mg）和3（33 mg）；组分4N 先后经石油醚-醋酸乙酯（15∶1～10∶1）洗脱和HPLC 色谱（柱温40 ℃，甲醇-水56∶44，tR＝11.320 min）分离得到化合物6（4.7 mg）；组分4H 经硅胶柱（二氯甲烷-甲醇100∶1～80∶1）和HPLC 色谱（甲醇-水68∶32）分离得到化合物7（28 mg）；组分4R 经硅胶柱（二氯甲烷-甲醇90∶1～70∶1）分离得到化合物5（21 mg）。流分3 用硅胶柱，以石油醚-丙酮系统（100∶1～1∶1）进行梯度洗脱，得到Fr.3A～3X 共24 个组分。组分3J 经凝胶柱和HPLC 色谱（柱温35 ℃，甲醇-水70∶30）分离得到化合物8（3.3 mg）。流分5 用硅胶柱，以石油醚-丙酮系统（100∶1～1∶1）进行梯度洗脱，得到Fr.5A～5M 共26 个组分。组分5B 经结晶得到化合物9（205 mg）；组分5J 经凝胶柱和重结晶得到化合物11（1.0 mg）；组分5E 先后经凝胶和硅胶柱（石油醚-醋酸乙酯50∶1～43∶1）分离得到化合物10（34 mg）和12（3.6 mg）。流分6 用硅胶柱，以石油醚-丙酮系统（100∶1～1∶1）进行梯度洗脱，得到Fr.6A～6J 共10 个组分。组分6G 经凝胶柱色谱分离得到化合物13（9.7 mg）。

2.2 抗炎活性研究

2.2.1 RAW264.7 细胞培养 在37 ℃、5% CO2环境下，向高糖DMEM 培养基中加入10%的胎牛血清，加入复苏的RAW264.7 细胞。取对数生长期的细胞，用胰酶消化，制成细胞悬液，计数并稀释细胞密度为8×104个/孔。以每孔200 μL 的量加入96孔板，待细胞在培养箱中培养36 h 后用于实验。

2.2.2 MTT 法检测药物对RAW264.7 细胞活力的影响 将对数生长期细胞调整细胞浓度为8×105个/孔，接种于96 孔板中，每孔200 μL，分为空白对照组、阳性对照组（阳性药物为DiDOX）和实验组（加入待测化合物）处理。细胞分别培养24 h 后，每孔加入20 μL MTT 溶液，继续培养2 h，弃去上清液，加入200 μL DMSO 避光振摇10 min，采用全波长酶标仪在570 nm 波长处检测各孔的吸光度（A）值，并按照公式计算细胞存活率。

细胞存活率＝A实验/A空白对照

2.2.3 单体化合物对RAW264.7 细胞释放NO 的测试 取对数生长期的RAW264.7 细胞，调整细胞浓度为2×105个/孔加入96 孔板中，每孔200 μL，在37 ℃、5% CO2环境下培养24 h，去除上清液，将细胞分为空白对照组（空白培养基）、LPS 组（1.0µg/mL LPS）、不同浓度的化合物（1.0 μg/mL LPS＋100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L）。各组细胞加入药物或空白培养基后，继续培养24 h。取上清液100 µL，加入100 µL Griess 试剂，室温放置10 min，波长设置为570 nm，在酶标仪上测定A，将其代入标准曲线中，标准曲线为A＝0.006 4C＋0.002 4，r＝0.999 7，其中A为吸光度，C为亚硝酸钠浓度，计算NO 释放量。

3 结果

3.1 结构鉴定

化合物1：白色无定形粉末。HR-ESI-MSm/z:317.211 1 [M－H]−，理论值为317.212 2，推测分子式为C20H30O3。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 5.69(1H, dd,J= 17.3, 10.4 Hz, H-15), 5.46 (1H, brs, H-14),4.96 (1H, dd,J= 10.4, 1.7 Hz, H-16), 4.84 (1H, dd,J=17.4, 1.7 Hz, H-16), 4.28 (1H, brs, H-7), 2.20 (1H, dt,J= 14.0 Hz, H-3β), 2.12 (1H, m, H-9), 2.10 (2H, m, H-6), 1.84 (1H, dd,J= 9.0, 7.0 Hz, H-5), 1.79 (1H, dt,J= 3.4, 13.9 Hz, H-2β), 1.72 (1H, brd,J= 13.1 Hz, H-1β), 1.59 (2H, m, H-11β, 12β), 1.47 (1H, dq,J= 3.0,14.0 Hz, H-2α), 1.27 (3H, s, H-18), 1.24～1.37 (2H, m,H-11α, 12α), 1.12 (1H, m, H-3α), 1.11 (1H, ddd,J=13.5, 13.5, 4.5 Hz, H-1α), 1.04 (3H, s, H-17), 0.63 (3H,s, H-20)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 183.4 (C-19),146.4 (C-14), 140.2 (C-8), 133.2 (C-15), 113.3 (C-16),73.2 (C-7), 48.3 (C-5), 45.7 (C-9), 39.2 (C-4), 39.2 (C-1), 43.6 (C-10), 38.5 (C-13), 37.9 (C-3), 35.5 (C-12), 30.6(C-6), 29.0 (C-18), 28.8 (C-17), 19.6 (C-2), 18.7 (C-11),13.0 (C-20)。以上数据与文献报道一致[7]，故鉴定该化合物为7β-羟基-8(14),15-二烯-19-异海松烷酸。

化合物2：白色无定形粉末。HR-ESI-MSm/z:315.195 2 [M－H]−，理论值为315.196 6，推测分子式为C20H28O3。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 6.58(1H, s, H-14), 5.68 (1H, dd,J= 17.5, 10.5 Hz, H-15),5.00 (1H, dd,J= 10.5, 1.4 Hz, H-16α), 4.76 (1H, dd,J= 17.5, 1.4 Hz, H-16β), 3.13 (1H, dd,J= 18.8, 13.6 Hz, H-6α), 2.81 (1H, dd,J= 18.8, 5.0 Hz, H-6β), 2.19(1H, m, H-9), 2.01 (1H, dd,J= 16.4, 5.0 Hz, H-5), 1.25(3H, s, H-20), 1.13 (3H, s, H-18), 0.76 (3H, s, H-17)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 200.6 (C-7), 182.1 (C-19), 145.7 (C-15), 142.8 (C-14), 136.8 (C-8), 114.3 (C-16), 51.7 (C-5), 50.4 (C-9), 44.0 (C-4), 39.3 (C-13),38.8 (C-12), 38.7 (C-1), 38.0 (C-3), 37.3 (C-10), 35.0(C-6), 28.4 (C-18), 28.3 (C-17), 19.6 (C-2), 19.1 (C-11),12.9 (C-20)。以上数据与文献报道一致[8]，故鉴定该化合物为7-oxo-ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid。

化合物3：白色无定形粉末。HR-ESI-MSm/z:331.226 8 [M－H]−，理论值为331.227 9，推测分子式为C21H31O3。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 5.70(1H, dd,J= 17.3, 10.4 Hz, H-15), 5.40 (1H, s, H-14),4.97 (1H, dd,J= 10.4, 1.7 Hz, H-16), 4.88 (1H, dd,J=17.3, 1.7 Hz, H-16), 3.60 (1H, t,J= 3.1 Hz, H-7), 3.16(3H, s, H-21), 2.15 (2H, m, H-3), 2.06 (1H, m, H-6),1.92 (1H, m, H-9), 1.76 (1H, m, H-5), 1.68 (2H, m, H-1), 1.60 (2H, m, H-12), 1.46 (2H, m, H-2), 1.34 (2H, m,H-11), 1.26 (3H, s, H-18), 1.08 (3H, s, H-17), 0.65 (3H,s, H-20)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 183.6 (C-19),146.4 (C-15), 135.5 (C-8), 134.5 (C-14), 113.2 (C-16),81.7 (C-7), 54.6 (C-21), 48.8 (C-5), 45.7 (C-9), 43.6 (C-4), 39.1 (C-10), 38.8 (C-1), 38.7 (C-13), 37.8 (C-3),35.5 (C-12), 29.9 (C-6), 29.6 (C-17), 28.8 (C-18), 19.5(C-2), 18.7 (C-11), 13.2 (C-20)。以上数据与文献报道一致[9]，故鉴定该化合物为7β-methoxy-ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid。

化合物4：白色无定形粉末。HR-ESI-MSm/z:299.200 7 [M－H]−，理论值为299.201 7，推测分子式为C20H28O2。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 6.6(1H, dd,J= 2.7, 11.6 Hz, H-6), 6.03 (1H, brd,J= 11.6 Hz，H-7), 5.72 (1H, dd,J= 17.2, 10.1 Hz, H-15), 5.24(1H, s, H-14), 4.96 (1H, dd,J= 10.3, 1.7 Hz, H-16),4.86 (1H, dd,J= 17.3, 1.8 Hz, H-16), 2.15～2.25 (1H,m, H-3), 2.04～2.10 (1H, m, H-5), 1.91～1.99 (1H, m,H-9), 1.79～1.91 (1H, m, H-11), 1.68～1.75 (2H, m,H-1), 1.60～1.66 (1H, m, H-12), 1.53～1.55 (1H, m,H-11), 1.50～1.53 (1H, m, H-2), 1.33 (3H, s, H-18),1.28～1.31 (1H, m, H-12), 1.24～1.28 (1H, m, H-2),1.07～1.09 (1H, m, H-3), 1.07 (3H, s, H-17), 0.63 (3H,s, H-20)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 180.9 (C-19),147.3 (C-15), 135.9 (C-8), 131.7 (C-14), 128.3 (C-7),127.4 (C-6), 113.1 (C-16), 55.5 (C-5), 49.3 (C-9), 43.2(C-4), 38.9 (C-13), 37.9 (C-10), 37.4 (C-3), 37.2 (C-1),35.4 (C-12), 29.0 (C-17), 28.2 (C-18), 19.5 (C-11), 18.6(C-2), 11.8 (C-20)。以上数据与文献报道一致[10]，故鉴定该化合物为ent-pimara-6,8(14),15-trien-19-oic acid。

化合物5：白色无定形粉末。HR-ESI-MSm/z:335.221 9 [M－H]−，理论值为335.222 8，推测分子式为C20H32O4。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 3.70(1H, d,J= 11.3 Hz, H-17α), 3.59 (1H, d,J= 11.3 Hz,H-17β), 2.11 (1H, d,J= 13.4 Hz, H-3α), 2.02 (1H, brs,H-13), 1.18 (3H, s, H-18), 0.98 (3H, s, H-20), 0.83 (1H,td,J= 13.0, 4.0 Hz, H-1β)；13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 181.5 (C-19), 82.8 (C-16), 66.8 (C-17), 58.0(C-5), 57.3 (C-9), 53.7 (C-15), 46.2 (C-13), 45.7 (C-8),44.6 (C-4), 43.2 (C-7), 41.8 (C-1), 40.7 (C-10), 39.1 (C-14), 38.1 (C-3), 29.3 (C-18), 27.1 (C-12), 23.2 (C-6),20.1 (C-2), 19.5 (C-11), 16.1 (C-20)。以上数据与文献报道一致[11]，故鉴定该化合物为16α,17-dihydroxyent-kaur-19-oic acid。

化合物6：白色无定形粉末。HR-ESI-MSm/z:319.226 8 [M－H]−，理论值为319.227 9，推测分子式为C20H32O3。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 3.29 (1H,s, H-17), 1.17 (3H, s, H-18), 0.96 (3H, s, H-20), 0.92～0.81 (1H, m, H-1β)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ:181.8 (C-19), 67.9 (C-17), 58.5 (C-5), 57.1 (C-9), 46.5 (C-15), 46.1 (C-8), 44.8 (C-4), 44.6 (C-16), 43.1 (C-14), 42.3(C-1), 41.0 (C-10), 39.7 (C-13), 39.4 (C-7), 38.2 (C-3),32.7 (C-12), 29.7 (C-18), 23.9 (C-6), 20.5 (C-2), 20.1 (C-11), 16.5 (C-20)。以上数据与文献报道一致[12]，故鉴定该化合物为17-hydroxy-ent-kaur-19-oic acid。

化合物7：白色无定形粉末。HR-ESI-MSm/z:315.195 5 [M－H]−，理论值为315.196 6，推测分子式为C20H28O3。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 6.04(1H, dd,J= 17.7, 10.9 Hz, H-15α), 5.07 (1H, d,J=10.8 Hz, H-16), 4.97 (1H, d,J= 17.6 Hz, H-16), 2.40(2H, m, H-6α, 6β), 2.19 (1H, d,J= 13.0 Hz, H-3α), 2.11(1H, m, H-11α), 2.00 (1H, m, H-7β), 2.42 (1H，m, H-7α), 1.96 (1H, m, H-2α), 1.95 (1H, m, H-1α), 1.92 (1H,m, H-12α), 1.80 (1H, m, H-12β), 1.78 (1H, m, H-11β),1.56 (1H, m, H-2β), 1.35 (1H, brd,J= 12.5 Hz, H-5β),1.24 (3H, s, H-19β), 1.21 (1H, m, H-1β), 1.14 (3H, s,H-17), 1.07 (1H, d,J= 4.2 Hz, H-3β), 1.04 (3H, s, H-20)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 204.5 (C-14),181.0 (C-18), 165.2 (C-9), 143.4 (C-15), 130.1 (C-8),113.1 (C-16), 53.1 (C-5), 47.3 (C-13), 44.4 (C-4), 40.9(C-10), 38.2 (C-3), 37.1 (C-1), 34.6 (C-12), 28.7 (C-19),26.3 (C-7), 22.2 (C-17), 22.1 (C-6), 20.7 (C-11), 20.2 (C-2), 17.8 (C-20)。以上数据与文献报道一致[13]，故鉴定该化合物为melanocane E。

化合物8：白色无定形粉末。[α]20D−40.4 (c0.10,MeOH)；, 2909, 1696, 1639, 1416, 1265,814。HR-ESI-MSm/z: 287.164 1 [M－H]−，理论值为287.165 3，推测分子式为C18H24O3，不饱和度为7。1H-NMR（表1）显示有2 个角甲基 [δH1.12 (s), 1.27(s)] 和1 个双键相连甲基 [δH2.14 (s)] 的存在。通过13C-NMRδC122.7 (C-8), 147.2 (C-9), 116.6 (C-11),127.4 (C-12), 120.3 (C-13), 151.7 (C-14) 6 个C 信号可以确定苯环的存在，δH6.73 (J= 8.4 Hz), 6.84 (J= 8.4 Hz) 为苯环上的2 个相邻质子。通过HMBC（图1）中δH6.84 (J= 8.4 Hz) 与C-9、C-11 和C-14 信号相关，δH6.73 (J= 8.4 Hz) 与C-8、C-9 和C-13 信号相关，确定苯环氢位于11 和12 位；通过HMBC 中H-7 和H3-15 与C-14 的相关信号可推测出羟基在14 位；通过HMBC 中H3-16 与δC180.1 相关可推测羧基在17 位。根据HMBC 中δC147.2 与H-7、H-12、H-18 的相关，δC122.7 与H-6、H-7、H-11 相关，δC38.1 与H-1、H-2、H-5、H-18 的相关可进一步证实其结构。根据1H-1H COSY 中H-1 与H-2 的相关，H-2 与H-3、H-5 与H-6、H-6 与H-7、H-11与H-12 的相关，结合HMBC 中信息，可确定其平面结构（图1）。通过NOESY 谱中H-5 与H-1β、H-7β、H-16 相关，推断其相对构型（图2）。结合以上数据，并与已知相似化合物[8]比对，化合物8 的结构确定为 14-hydroxy-16-devinyl-ent-pimara-8,11,13-trien-17-oic acid，经Sci-finder 检索，是1 个新的降海松烷型二萜，命名为细柱五加酸G1。

图1 化合物8 的结构（左）和关键HMBC (→)、1H-1H COSY (━) 相关（右）Fig.1 Structure (left), key HMBC (→) and 1H-1H COSY(━) correlations (right) of compound 8

图2 化合物8 的关键NOESY 相关 (↔)Fig.2 Key NOESY correlations (↔) of compound 8

表1 化合物8 的 1H- 和 13C-NMR 数据 (600/150 MHz,CD3OD)Table 1 1H- and 13C-NMR spectroscopic data for compound 8 (600/150 MHz, CD3OD)

化合物9：白色无定形粉末。HR-ESI-MSm/z:301.216 7 [M－H]−，理论值为301.217 3，推测分子式为C20H30O2。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 4.80(1H, brs, H-17α), 4.74 (1H, brs, H-17β), 2.64 (1H, brs,H-13), 2.23 (2H, m, H-15), 2.16 (1H, d,J= 12.0 Hz, H-3), 2.05 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-16), 1.99 (1H, dd,J=11.2, 2.2 Hz, H-14), 1.87 (2H, m, H-1, 2), 1.82 (2H, m,H-6), 1.60 (2H, m, H-11), 1.52 (2H, dt,J= 3.5, 13.0 Hz,H-7), 1.46 (2H, m, H-12), 1.43 (1H, m, H-2), 1.24 (3H,s, H-19), 1.14 (1H, dd,J= 11.4, 5.0 Hz, H-14), 1.06 (H,d,J= 5.2 Hz, H-5), 1.03 (1H, d,J= 7.0 Hz, H-9), 1.00(1H, dt,J= 4.5, 13.5 Hz, H-3), 0.95 (3H, s, H-18), 0.81(1H, dt,J= 13.4, 3.6 Hz, H-1), 0.76 (1H, s, H-20)；13CNMR (150 MHz, CDCl3)δ: 183.4 (C-19), 155.8 (C-16),103.0 (C-17), 57.1 (C-5), 55.2 (C-9), 49.0 (C-15), 44.2(C-8), 43.9 (C-13), 43.7 (C-4), 41.3 (C-7), 40.7 (C-1),39.7 (C-14), 39.6 (C-10), 37.8 (C-3), 33.1 (C-12), 28.9(C-18), 21.8 (C-6), 19.1 (C-2), 18.4 (C-11), 15.6 (C-20)。以上数据与文献报道一致[14]，故鉴定该化合物为ent-kaur-16-en-19-oic acid。

化合物10：白色无定形粉末。HR-ESI-MSm/z:317.211 4 [M－H]−，理论值为317.212 2，推测分子式为C20H30O3。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 9.59(1H, d,J= 1.6 Hz, H-17), 2.62 (1H, t,J= 5.3, 9.2 Hz,H-16), 2.00～2.03 (1H, m, H-3α), 1.30～1.85 (8H, m,H-2α, 3β, 11, 12, 14α), 1.10 (3H, s, H-18), 0.86 (3H, s,H-20), 0.75～0.83 (1H, m, H-1β)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 203.9 (C-17), 178.6 (C-19), 56.0 (C-5), 54.6 (C-9), 52.7 (C-16), 48.6 (C-8), 44.6 (C-4), 42.9(C-7), 40.8 (C-1), 40.4 (C-15), 39.1 (C-10), 37.7 (C-13), 37.3 (C-3), 37.0 (C-14), 30.5 (C-12), 28.6 (C-18),22.2 (C-6), 18.9 (C-2), 18.3 (C-11), 15.4 (C-20)。以上数据与文献报道一致[15]，故鉴定该化合物为17-oxoent-kaur-19-oic acid。

化合物11：白色无定形粉末。HR-ESI-MSm/z:317.211 8 [M－H]−，理论值为317.212 2，推测分子式为C20H30O3。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 5.74(1H, dd,J= 16.8, 10.2 Hz, H-15), 5.60 (1H, brs, H-14),4.95 (1H, dd,J= 10.8, 2.4 Hz, H-16), 4.94 (1H, dd,J=16.8, 1.8 Hz, H-16), 3.87 (1H, brs, H-7), 2.80 (1H, ddd,J= 12.7, 4.7, 1.2 Hz, H-6β), 2.55 (1H, q,J= 12.7 Hz, H-6α), 2.24 (2H, dt,J= 14.0 Hz, H-3β), 2.16 (1H, m, H-9),1.86 (1H, dd,J= 9.6, 7.8 Hz, H-5), 1.79 (1H, dt,J= 13.8,4.8 Hz, H-2β), 1.73 (1H, brd,J= 13.2 Hz, H-1β), 1.59(2H, m, H-11β, 12β), 1.44 (1H, dq,J= 14.4, 4.2 Hz, H-2α), 1.25 (3H, s, H-18), 1.25～1.36 (2H, m, H-11α,12α), 1.12 (1H, m, H-3α), 1.11 (1H, ddd,J= 13.2, 13.2,6.6 Hz, H-1α), 1.04 (3H, s, H-17), 0.67 (3H, s, H-20)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 181.1 (C-19), 148.2 (C-15), 141.6 (C-8), 125.8 (C-14), 113.5 (C-16), 73.4 (C-7),54.1 (C-5), 50.0 (C-9), 44.6 (C-10), 40.2 (C-4), 40.1 (C-1), 39.1 (C-3), 39.0 (C-13), 36.5 (C-12), 34.9 (C-6), 29.7(C-17), 29.4 (C-18), 20.6 (C-2), 20.3 (C-11), 14.3 (C-20)。以上数据与文献报道一致[7]，故鉴定该化合物为7αhydroxy-ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid。

化合物12：白色无定形粉末。HR-ESI-MSm/z:317.195 8 [M－H]−，理论值为315.196 6，推测分子式为C20H28O3。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 9.73(1H, s, H-17), 6.57 (1H, s, H-15), 3.04 (1H, d,J= 3.6 Hz, H-13), 2.17 (1H, d,J= 10.8 Hz, H-3α), 1.26 (3H,s, H-18), 1.00 (3H, s, H-20), 0.83 (1H, td,J= 16.8, 12.6 Hz, H-1β)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 189.3 (C-17), 182.2 (C-19), 161.3 (C-15), 148.7 (C-16), 56.6 (C-5), 50.9 (C-9), 46.0 (C-8), 43.7 (C-4), 43.0 (C-7), 40.6(C-1), 40.1 (C-10), 38.2 (C-14), 37.9 (C-13), 37.8 (C-3), 28.9 (C-18), 25.1 (C-12), 20.2 (C-6), 19.0 (C-2), 18.7(C-11), 15.5 (C-20)。以上数据与文献报道一致[16]，故鉴定该化合物为17-oxo-ent-kaur-15-en-19-oic acid。

化合物13：白色无定形粉末。HR-ESI-MSm/z:317.211 2 [M－H]−，理论值为317.212 2，推测分子式为C20H30O3。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 5.37(1H, d,J= 10.3 Hz, H-15), 4.19 (2H, d,J= 2.0 Hz, H-16), 2.54～2.58 (1H, m, H-13), 2.10 (1H, m, H-3α),1.23 (3H, s, H-18), 0.98 (3H, s, H-20), 0.80～0.94 (1H,m, H-1β)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 182.4 (C-19), 146.4 (C-16), 135.9 (C-15), 61.7 (C-17), 57.1 (C-5), 49.3 (C-8), 48.0 (C-9), 44.3 (C-7), 44.0 (C-4), 41.5(C-13), 41.1 (C-1), 40.2 (C-10), 39.6 (C-14), 38.4 (C-3),29.3 (C-18), 25.9 (C-12), 21.1 (C-6), 19.5 (C-2), 19.3 (C-11), 15.8 (C-20)。以上数据与文献报道一致[16]，故鉴定该化合物为17-hydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid。

3.2 抗炎活性筛选结果

3.2.1 单体化合物对细胞RAW264.7 细胞活力的影响 与空白对照组相比，13个化合物浓度在3.125～100 μmol/L，细胞活力在80%以上，无显著性差异，可认为在3.125～100 μmol/L 受试样品未出现细胞毒性，因此实验选择在此质量浓度比较不同样品的抗炎作用的优劣。

3.2.2 单体化合物对LPS 刺激RAW264.7 细胞中NO 的含量测定 为了明确五加皮中分离得到的单体化合物的抗炎作用，采用MTT 法进行了细胞毒性实验，空白对照组的细胞存活率为100%。与LPS组相比，8 种化合物均具有抗炎活性，化合物1～3、7 具有较强的抗炎活性，并且化合物1～5、7、9、10 随着质量浓度的增加，NO 的含量减少，抗炎活性增强；化合物6、9 质量浓度在25～100 μmol/L 时有抗炎活性，低质量浓度时并未发挥抗炎活性（图3）。

图3 13 个化合物对NO 释放的抑制情况 (n = 3)Fig.3 Inhibitory activities of 13 compounds (n = 3)

4 讨论

从五加皮中共得到13 个二萜类化合物，分别为7 个海松烷型二萜化合物1～4、7、8、11，以及6个贝壳杉烷型二萜化合物5、6、9、10、12、13。化合物8 为1 个新的降海松烷型二萜，化合物3 和4为在首次该植物中发现。

体外抗炎活性研究发现，海松烷型二萜的抗炎活性普遍高于贝壳杉烷型类化合物。对海松烷型二萜抗炎作用结果进行比较发现，这类化合物7 位取代活性顺序为β-OH＞β-OCH3＞Δ6双键＞C=O＞α-OH（活性顺序为1＞3＞4＞2＞11）。

本实验分离鉴定的五加皮二萜类化合物及其活性研究，为五加皮药材及制剂的质量控制方法建立、药用资源合理开发和利用提供了依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突