基于HPLC 指纹图谱及多成分定量测定的痹祺胶囊质量评价

刘 冰，赵 晨，王 静，杜思邈，卜睿臻，郑新元，周 军，王 杰*

1.天津市药品检验研究院，天津 300070

2.天津达仁堂京万红药业有限公司，天津 300112

痹祺胶囊（Biqi Capsules）是天津市达仁堂京万红公司生产的独家品种，由马钱子粉、党参、白术、丹参、牛膝、地龙、茯苓、川芎、三七、甘草共10味药材组成，其功效益气养血、祛风除湿、活血止痛。用于气血不足、风湿瘀阻、肌肉关节酸痛、关节肿大、僵硬变形或肌肉萎缩、气短乏力；风湿、类风湿性关节炎、腰肌劳损、软组织损伤属上述证候者。其质量标准收载于《中国药典》2020 年版一部，检验项目包括性状、显微鉴别、薄层鉴别、胶囊检查项、马钱子粉中士的宁、马钱子碱的含量测定[1]。痹祺胶囊处方来源于汉代名医华佗传世验方“一粒仙丹”，马钱子是痹祺胶囊的“君药”，有大毒，具有散寒消肿、通络止痛作用；臣药由党参、白术、茯苓、丹参构成，党参、白术、茯苓健脾益气，丹参养血和血，四药同用益气养血，切中病机为臣药；佐药由三七、川芎、牛膝、地龙构成，活血化瘀，通络止痛，共为佐药；甘草调和诸药为使药。诸药配伍，共奏益气养血、祛风除湿、活血止痛之效[2]。痹祺胶囊临床主要应用于类风湿性关节炎、膝骨性关节炎，颈椎病、腰椎间盘突出等症[3-8]。目前，痹祺胶囊参考文献集中在化学成分、药理药效等方面，尚无指纹图谱方面的研究。痹祺胶囊文献中含量测定方面的较少，主要集中于马钱子中士的宁和马钱子碱的含量测定，也有同时测定丹参中丹酚酸B 的含量[9-11]。

刘昌孝院士[12-13]于2016 年正式提出中药QMarker 新概念和核心理论，建立了中药质量控制系列共性关键技术，构建中药质量研究新模式，并以痹祺胶囊中马钱子为例阐述了炮制中药的 QMarker。张星艳等[14]以痹祺胶囊药效学、药动学研究为实例，在Q-Marker 理论的指导下，从特有性、可测性、有效性和中药理论关联性等方面对痹祺胶囊的研究进行总结分析，发现士的宁、马钱子碱、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隐丹参酮和丹参酮IIA可作为该复方的Q-Marker。本实验在Q-Marker 的理论指导下[15-17]，通过网络药理学预测相应化学成分的基础上，采用常见的HPLC 法，结合上述研究基础，建立痹祺胶囊的指纹图谱方法，并选取特征明显的化学成分进行含量测定，用于痹祺胶囊的全面质量评价。

1 仪器与试药

Waters e2695 高效液相色谱仪，美国Waters 公司；Shimadzu LC-20AD 高效液相色谱仪，日本岛津公司；Agilent 1260 Infinity II 高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；Mettler XS205 型精密天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

对照品丹酚酸B（批号111562-201917，质量分数96.6%）、党参炔苷（批号111732-201908，质量分数≥90%）、士的宁（批号110705-201307，质量分数97.1%）、马钱子碱（批号110706-201306，质量分数91.7%）、丹参素钠（批号110855-201915，质量分数97.8%）、迷迭香酸（批号111871-202007，质量分数98.1%）、丹参酮IIA（批号111766-201520，质量分数98.9%）、三七皂苷R1（批号110745-201921，质量分数90.4%）、人参皂苷Rg1（批号110703-202034，质量分数94.0%）、人参皂苷Rb1（批号110704-202129，质量分数94.3%）、阿魏酸（批号111773-201915，质量分数99.4%）、藁本内酯（批号111737-201910，质量分数≥90%）、β-蜕皮甾酮（批号111638-201907，质量分数98.3%）、次黄嘌呤（批号140661-202005，质量分数99.4%）、甘草苷（批号111610-201908，质量分数95.0%）、甘草次酸（批号110723-201715，质量分数99.6%）、甘草酸铵（批号110731-202021，质量分数96.2%），以上均购自中国食品药品检定研究院；对照品茯苓酸，批号DSTDF00101，质量分数98.0%，购自乐美天医药德思特生物；对照品白术内酯III，批号F0032856，质量分数98.5%，购自北京曼哈格生物科技有限公司；对照品牛膝皂苷D，批号08M-MXC-22-2，质量分数96.68%，购自Panphy 化学品公司。

处方饮片党参（批号1-2009007）、制马钱子粉（批号1-2004017）、茯苓（批号1-2007004）、白术（批号1-2008043）、丹参（批号1-2009002）、三七（批号1-2008036）、川芎（批号1-2007005）、牛膝（批号1-2008044）、地龙（批号1-2008024）、甘草（批号1-2008053），均由天津达仁堂京万红药业有限公司提供。

痹祺胶囊样品由天津达仁堂京万红药业有限公司提供，规格为0.3 g/粒，批号分别为311282、311284、311285、311393、311403、311413、311414、311415、311416、311417、311544、311545、311546、311554、311555、311556、311557、311558、311725，分别编号S1～S19。

乙腈（液质联用级）、甲醇（色谱纯），天津市康科德科技有限公司；磷酸，分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司：实验用水为去离子水，Milli-Q 超纯水仪。

2 方法与结果

2.1 指纹图谱研究

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Shiseido Capcell Pak C18MG II 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～8 min，2%～12%乙腈；8～20 min，12%～25%乙腈；20～32 min，25%～30%乙腈；32～35 min，30%～45%乙腈；35～60 min，45%～55%乙腈；60～70 min，55%～65%乙腈；70～75 min，65%～95%乙腈；75～80 min，95%乙腈；80～81 min，95%～2%乙腈；81～90 min，2%乙腈；体积流量1.0 mL/min；柱温为35 ℃；检测波长203 nm；进样体积10 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 取丹酚酸B 对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为0.2 mg/L 的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取本品装量差异项下内容物，研细，取约1 g，精密称定，精密加入甲醇10 mL，密塞，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.4 精密度试验 取同一批（批号S19）痹祺胶囊，按“2.1.3”项下方法操作，连续测定6 次，记录各共有峰的保留时间和峰面积，以丹酚酸B 为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。36 个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取同一批（批号S19）痹祺胶囊，按“2.1.3”项下方法操作，分别在0、3.0、7.5、12.0、19.5、24.0 h 进样，记录各共有峰的保留时间和峰面积，以丹酚酸B 为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。36 个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD 均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 取同一批（批号S19）痹祺胶囊，按“2.1.3”项下方法操作，平行制备6 份，分别进样，记录各共有峰的保留时间和峰面积，以丹酚酸B 为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。36 个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD 均小于3.0%，表明该方法重复性较好。

2.1.7 指纹图谱的建立及相似度分析 取收集的19 批样品，按“2.1.3”项下样品处理方法平行2 份操作，按“2.1.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图，所得图谱以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012 年版处理，以S1 为参照，时间窗为0.10，mark 峰匹配方式，对照图谱生成以平均数计算，生成对照指纹图谱。各批样品（S1～S19）与对照指纹图谱相比较，相似度测定结果分别为0.992、0.992、0.992、0.993、0.975、0.994、0.996、0.992、0.992、0.994、0.991、0.990、0.991、0.991、0.991、0.991、0.989、0.991、0.973，相似度在0.973～0.996，表明各批次之间相似度良好。19 批样品的叠加指纹图谱和对照指纹图谱见图1。

图1 19 批 (S1～S19) 痹祺胶囊的HPLC 指纹图谱及对照指纹图谱 (R)Fig.1 HPLC fingerprints of 19 batches (S1—S19) of Biqi Capsules and reference fingerprint (R)

2.1.8 共有峰的归属 取处方中的10 味药材，分别按“2.1.3”项下供试品处理方法制备药材供试品溶液，并与对照品溶液按“2.1.1”项下色谱条件进样检测，先将药材及对照品与制剂比对，确定保留时间相同的色谱峰，再用二极管阵列检测器中光谱图进行验证，最终选取了归属明确、指纹性强的色谱峰，确定了36 个峰作为共有峰。结果见表1。

表1 共有峰的归属Table 1 Attribution of common peaks

2.2 含量测定研究

在上述指纹图谱研究基础上，兼顾君臣佐使的原则，选取具有代表性的化学成分进行含量测定研究。君药中马钱子粉已有士的宁、马钱子碱含量测定方法；本实验选取臣药丹参中丹酚酸B、佐药川芎中阿魏酸、使药甘草中甘草苷进行含量测定研究。

2.2.1 对照品溶液的制备 取甘草苷对照品、阿魏酸对照品、丹酚酸B 对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为甘草苷30 μg/mL、阿魏酸5 μg/mL、丹酚酸B 60 μg/mL 的混合溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，研细，取约0.5 g，精密称定，精密加入75%甲醇25 mL，密塞，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按处方配比，分别取除甘草、川芎、丹参外其他药材，按制法项下的工艺制成制剂，再按“2.2.3”供试品溶液制备方法，分别制得缺甘草、川芎、丹参的阴性样品溶液。

2.2.4 色谱条件 色谱柱为Shiseido Capcell Pak C18MG II 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水-磷酸（21∶79∶0.1）；体积流量1.0 mL/min；柱温为40 ℃；以二极管阵列检测器检测，甘草苷检测波长为276 nm，阿魏酸检测波长为321 nm，丹酚酸B 检测波长为286 nm；进样体积10 μL。典型色谱图见图2。

图2 混合对照品 (276 nm, A; 321 nm, D; 286 nm, G)、痹祺胶囊供试品 (276 nm, B; 321 nm, E; 286 nm, H)、缺甘草的痹祺胶囊阴性对照 (276 nm, C)、缺川芎的痹祺胶囊阴性对照 (321 nm, F)、缺丹参的痹祺胶囊阴性对照 (286 nm, I) 的HPLC 图Fig.2 HPLC of mixed reference substances (276 nm, A; 321 nm, D; 286 nm, G), Biqi Capsules test sample (276 nm, B; 321 nm, E; 286 nm, H), Biqi Capsules negative control solution lack of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (276 nm, C), Biqi Capsules negative control solution lack of Chuanxiong Rhizoma (321 nm, F), Biqi Capsules negative control solution lack of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma (286 nm, I)

2.2.5 线性关系考察 取甘草苷、阿魏酸、丹酚酸B 对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成质量浓度为甘草苷30.35 μg/mL、阿魏酸5.046 μg/mL、丹酚酸B 61.79 μg/mL 的混合对照品溶液，分别精密吸取1、3、5、10、15 μL，注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件进行分析，分别测定各自峰面积，以对照品进样量为横坐标（X），峰面积值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程：甘草苷Y＝1.923 4×106X＋6 135.7，r＝0.999 9；阿魏酸Y＝4.929 0×106X＋398.81，r＝0.999 9；丹酚酸BY＝1.250 8×106X＋13 053，r＝0.999 9；结果表明，甘草苷进样量在30.35～455.30 ng、阿魏酸进样量在5.046～75.690 ng、丹酚酸B 进样量在61.79～926.90 ng 与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.6 精密度试验 取同一批（S19）痹祺胶囊，按“2.2.3”项下方法操作，连续进样6 次，样品中甘草苷、阿魏酸和丹酚酸B 峰面积的RSD 分别为1.50%、1.11%、0.83%。

2.2.7 稳定性试验 取同一批（S19）痹祺胶囊，按“2.2.3”项下方法操作，分别在0、2.0、5.5、9.0、16.5、24.0 h 进样测定，结果甘草苷、阿魏酸和丹酚酸B 峰面积的RSD 分别为0.77%、1.46%、0.60%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.2.8 重复性试验 取同一批（S19）痹祺胶囊，按“2.2.3”项下方法操作，平行制备6 份，进样测定，结果甘草苷、阿魏酸和丹酚酸B 质量分数的RSD 分别为0.45%、1.05%、0.61%。

2.2.9 加样回收率试验 取已知含量的批号S19 样品0.25 g，平行6 份，精密称定，分别精密加入甘草苷对照品（质量浓度12.21 μg/mL）、阿魏酸对照品（质量浓度2.858 μg/mL）和丹酚酸B 对照品（质量浓度30.48 μg/mL）的75%甲醇溶液25 mL，按“2.2.3”项下方法制备供回收用供试品溶液，进样测定，计算各成分的平均加样回收率，结果甘草苷、阿魏酸和丹酚酸B 平均加样回收率分别为98.43%、102.12%、101.59%，RSD 分别为1.21%、1.48%、1.19%。

2.2.10 样品测定 取19 批（S1～S19）痹祺胶囊样品，按“2.2.3”项下方法操作，进样测定，计算甘草苷、阿魏酸和丹酚酸B 的含量，结果见表2，结果显示19 批（S1～S19）痹祺胶囊样品中成分甘草苷质量分数在0.630～1.428 mg/g，阿魏酸质量分数在0.188～0.260 mg/g，丹酚酸B 质量分数在2.539～3.442 mg/g，结果表明制剂工艺稳定。

表2 样品测定结果Table 2 Determination results of samples

3 讨论

3.1 色谱条件的确定

3.1.1 流动相的选择 本方由10 味药材组成，经粉碎混合后直接入药，成分复杂，刘建庭等[18]采用UPLC-Q/TOF-MS 方法对痹祺胶囊化学物质组及入血成分进行了研究，共鉴定出280 个化学成分，如白术中主要有11 个内酯类成分[19]；茯苓中主要有21 个三萜酸类成分；丹参中主要有53 个丹酚酸类和二萜醌类成分[20]；三七中主要有41 个为皂苷类成分[21]；甘草中主要有59 个黄酮类和三萜类成分。入血成分共得到81 个痹祺胶囊相关的外源性化合物，包括59 个吸收原型药物成分和22 个代谢产物。指纹图谱实验流动相首选采用梯度洗脱程序[22]，试验中分别采用过甲醇-1%冰醋酸水溶液与乙腈-0.1%磷酸水溶液系统进行测定，经比较，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液进行梯度洗脱，色谱图基线平直，色谱峰数目多并且分离度较好。含量测定选用较为简单的等度洗脱，以节约时间成本及试剂成本，最终确定乙腈-水-0.1%磷酸（21∶79∶0.1），各相关成分分离度均＞1.5，分离效果较好。

3.1.2 检测波长的选择 指纹图谱研究中采用二极管阵列检测器，在波长200～400 nm 扫描，并分别在203、254、280、321 nm 检测波长下色谱图进行比较，203 nm 所得的色谱图不论在色谱峰数目及色谱峰强度上均优于其他波长处色谱图，故确定203 nm 作为检测波长。含量测定中3 种成分光谱图差异较大，选取单一波长测定较为困难，故采用多波长同时测定，分别选取3 种成分的最大吸收波长作为检测波长：甘草苷检测波长为276 nm，阿魏酸检测波长为321 nm，丹酚酸B 检测波长为286 nm。

3.1.3 其他色谱条件的选择 指纹图谱实验中分别选用Shiseido Capcell Pak C18MG II（250 mm×4.6 mm，5 µm）、Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）、Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）3 种不同品牌的色谱柱；分别进行不同柱温；不同体积流量进行筛选，最终选取Shiseido Capcell Pak C18MG II（250 mm×4.6 mm，5 µm）色谱柱，35 ℃柱温以及1.0 mL/min 体积流量的色谱条件。

3.2 供试品溶液制备的确定

指纹图谱及含量测定实验考察了供试品溶液的提取方式（超声处理、加热回流）、提取溶剂（50%、75%、100%甲醇）、提取时间（15、30、45、60 min），指纹图谱提取溶剂量（10、20 mL）、含量测定提取溶剂量（25、50 mL）对各成分提取效率的影响，综合考虑，最终确定供试品溶液制备方法。

3.3 耐用性考察

取同一批痹祺胶囊（批号S19），指纹图谱采用不同批号色谱柱及不同品牌仪器，含量测定采用不同品牌色谱柱及不同仪器品牌，分别按相应的色谱条件进样检测，指纹图谱相似度在0.964～0.976，含量测定测定结果均在2%以内，结果表明色谱柱与仪器均无影响。

3.4 指纹图谱共有峰的确定

痹祺胶囊由10 味药材组成，均为生粉入药，确定的36 个共有峰中1、2、8、32、35 号峰归属于多个药材，其余峰均归属于单一药材。从药材分析，茯苓药材峰数最少，仅有2 个，甘草药材峰数最多，共计11 个，与甘草中成分吸收值较高相关，党参、牛膝、白术、茯苓、地龙等5 味药材其峰面积吸收值整体偏低，党参炔苷、β-蜕皮甾酮等成分在指纹图谱未检出，一方面是因为这些成分在药材中本身含量较低，另一方面是因为有的成分无明显的紫外吸收。

本实验建立的HPLC 指纹图谱及含量测定方法操作简便，重复性好，建立的对照指纹图谱中10 味药材均有体现，通过相似度的测定，19 批痹祺胶囊的相似度测定结果均在0.97 之上，表明痹祺胶囊生产工艺稳定，质量一致性较好，该方法可用于痹祺胶囊质量的全面评价。本实验通过采用中药QMarker 理论，重点开展指纹图谱-含量测定相应检测方法，达到“指纹成分-工艺过程可重现性”“质量物质可测性”和“质量标准稳定性”相关要素研究，为建立痹祺胶囊药品全新的质量管理体系提供科学依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突