基于黑苹果果皮花青素的虾鲜度指示膜的制备及应用

陈柯君，杨周昊，余虹达，程桂广，覃宇悦,*，李 琳

（1.昆明理工大学食品科学与工程学院，云南 昆明 650600；2.东莞理工学院生命健康技术学院，广东 东莞 523808）

近年来，智能包装因其具备能够及时追溯食品安全的能力而受到广泛关注。智能指示膜可以监控包装内食品条件的变化，在食品储存期间提供有关食物品质的信息。一般来说，食物变质与pH值变化密切相关[1]，pH值敏感智能指示膜可以通过肉眼可见的颜色变化来反映包装内食品pH值变化情况，从而为食品制造商或消费者提供即时信息，是一种新颖的智能食品包装。

智能指示膜由两部分组成，即固体载体和染料。商业pH指示膜经常使用化学合成染料，如氯酚（红色）、溴甲酚（紫色）和溴苯酚（蓝色）等，然而化学染料具有一定的毒性，考虑到染料的安全性和环保性，研究越来越集中在使用天然色素来代替化学合成染料上[2]。花青素是植物中的水溶性天然色素[3]，具有安全、无毒、对pH值变化敏感的特点，花青素的pH值敏感性变色特性来自于花青素的离子性质，花青素在酸性环境下呈现红色或粉红色，在碱性环境下呈现蓝色或黄色。因此，花青素可作为天然pH值敏感指示剂用于监测pH值变化。一些天然花青素，例如从桫椤根[4]、蓝莓[5]、桑椹[6]、黑豆[7]中获得的花青素，已被研究用于实时监测食物新鲜度。

黑苹果（‘黑卡嘎啦’），又名紫霞仙子，源自西藏林芝，产自云南昭通，特殊的苹果品种和独特的高原自然地理条件和超强的紫外线造就了其黑宝石般外观。黑苹果产自海拔3 500 m以上完全天然的环境下，气候温差大、气温较低，黑苹果的生长速度较慢，但这样的气候使得黑苹果的虫害少、糖分高、品质口感好，同时也孕育了黑苹果外表独特的颜色。黑苹果果皮呈深紫色是由于果皮中含有大量花青素，其中主要花青素种类为矢车菊-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷，前者含量显著高于后者[8]。黑色作为苹果的颜色尤为引人注目，其独特的外观使得‘黑卡嘎啦’成为苹果市场的热门水果。其果型长圆、外观周正、果面光滑、无果锈、表皮富有光泽；且果实鲜艳、肉质细脆、酸甜适口，深受人们欢迎。目前，将黑苹果果皮花色苷作为颜色指示剂添加到膜基质材料中的研究鲜见报道。

近年来，人们越来越关注使用可生物降解和环保聚合物，如多糖、蛋白质、脂质，作为智能和活性包装薄膜的固体载体。壳聚糖（chitosan，CS）是天然多糖中唯一的碱性多糖，它具有优异的薄膜成型性、高透明度、生物降解性、生物相容性、抗菌活性等多种生理功能，被广泛用于生物医学材料和食品添加剂。但是，仅由CS制成的薄膜表现出较差的机械性能和强亲水性能。海藻酸钠（sodium alginate，SA）是一种食品级多糖，具有良好的成膜性能，将其与CS按质量比1∶9共混成膜时可以获得复合膜的最佳性能[9]，以满足食品包装的需求。

本实验以CS和SA为成膜基材，通过添加黑苹果果皮花青素（black apple peel anthocyanin，BAA），采用溶液浇铸法制备CS-SA-BAA指示膜，研究BAA添加量对复合膜性能的影响，得到CS-SA-BAA指示膜的最佳制备工艺条件，并对制备出的最优指示膜进行表征及用于虾新鲜度监测研究，以期为天然花青素指示膜应用于食品货架期监测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑苹果（‘黑卡嘎啦’）购于云南省昭通市；基围虾购于云南省昆明市呈贡区农贸市场。

CS（脱乙酰度75%） 郑州佳智生物科技有限公司；SA 浙江一诺生物科技有限公司；所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

AS超声波清洗机 天津奥特赛恩斯仪器有限公司；TRP-6冻干机 北京北仪优成真空技术有限公司；DGH-9070型电热恒温鼓风干燥箱 上海中友仪器设备有限公司；Heizbad Hei-VAP旋转蒸发仪 德国海道夫仪器有限公司；PHS-3E pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；WSC-S测色色差仪 上海精科仪器有限公司；DL9325千分尺 宁波得力工具有限公司；GL-3250A磁力搅拌器 海门市其林贝尔有限公司；NOVA NANOSEM-450场发射扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM） 美国FEI有限公司；SANS CMT 4104微机型拉力试验机 湖北MTS系统有限公司；T9CS双光束紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；ALPHA红外光谱仪 德国耐驰仪器商贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 BAA提取物的制备

参照文献[10]的方法对黑苹果果皮中的花青素进行提取。将黑苹果用自来水洗涤干净后自然干燥，后将黑苹果去皮，将黑苹果果皮放在烘箱中35 ℃烘烤4 h后粉碎成粉末备用。约50 g黑苹果果皮浸泡在500 mL体积分数75%的乙醇溶液中（料液比1∶10），并在和黑暗的条件下室温超声处理30 min，在40 ℃下蒸发以除去多余的乙醇，得到BAA提取物。

1.3.2 BAA溶液的紫外-可见光谱测定

用0.1 mol/L NaOH溶液或0.1 mol/L HCl溶液调节制备pH值为1～14的溶液，将1 mL不同pH值溶液与1 mL BAA提取物混合，拍照记录溶液颜色的变化，并利用双光束紫外-可见分光光度计（450～700 nm）测定溶液的紫外-可见光谱图。

1.3.3 智能指示膜的制备

指示包装膜的制备参考文献[11]的溶液浇铸法并改良。将1.8 g CS粉末溶于90 mL体积分数2%的乙酸水溶液中，将0.2 g SA粉末溶于10 mL蒸馏水中，然后将两种溶液混合，加入1 g甘油进行搅拌。将BAA提取物（基于薄膜聚合物基总体积的10%、15%、20%）加入在混合溶液中。使用磁力搅拌器进行搅拌、混匀，然后将所得溶液倒入20 cm×20 cm的玻璃板中，在35 ℃、相对湿度50%的条件下干燥12 h。将含有0、10%、15%、20%的BAA提取物的CS-SA薄膜分别命名为CS-SA薄膜、CS-SABAA10薄膜、CS-SA-BAA15薄膜、CS-SA-BAA20薄膜。

1.3.4 厚度测定

薄膜样品的厚度由千分尺测定，精度为0.001 mm，在薄膜的5 个随机位置进行测量并计算平均值。

1.3.5 水分质量分数测定

通过在105 ℃下将薄膜样品干燥至恒定质量来测定水分质量分数。

1.3.6 机械性能测定

根据GB/T 1040.1—2006《塑料 拉伸性能的测定》，将制备的薄膜剪裁成15 mm×100 mm大小，采用微机型拉力试验机测定拉伸强度（tensile strength，TS）和断裂伸长率（elongation at break，EAB），拉伸速率设定为50 mm/min[12]。

1.3.7 SEM观察微观形貌

在分析前，将薄膜进行喷金处理，喷金层厚约10 nm，在放大5 000 倍条件下利用SEM对其表面微观形貌进行观察。

1.3.8 傅里叶变换红外光谱测定

采用ALPHA红外光谱仪在4 000～400 cm－1范围内测定傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）图，在光谱分辨率4 cm－1下进行16 次扫描。

1.3.9 紫外线透过率测定

使用双光束紫外-可见分光光度计测定复合薄膜的紫外-可见光透过率，波长范围为200～800 nm，将1 cm×4 cm的薄膜置于比色皿中，并将空比色皿作为对照[13]。

1.3.10 颜色测定

采用WSC-S测色色差计，以D65为光源，测量了复合薄膜的L*值（光/暗）、a*值（红/绿）、b*值（黄/蓝）。薄膜的色差ΔE按下式计算。

式中：L（91.29）、a（－0.89）和b（3.76）表示用于校准的白板颜色值。

1.3.11 智能指示膜对不同pH值的响应性测定

将复合薄膜切片成方形（2 cm×2 cm），在pH 1～14的溶液中浸泡5 min，取出晾干薄膜表面水分，拍照记录薄膜的颜色变化。

1.3.12 虾新鲜度的监测

选用CS-SA-BAA15智能指示膜对虾新鲜度进行监测。将虾放在保鲜盒中，并将CS-SA-BAA15智能指示膜标签置于虾的上侧，保鲜盒密封放在（4±1）℃冰箱中保存6 d，每天拍摄一次智能指示膜的变化情况，并测定CS-SA-BAA15智能指示膜的颜色参数（L、a、b值和ΔE）。虾的pH值和总挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量分别按照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》和GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》进行测定。

1.4 数据统计分析

使用SPSS软件对实验数据进行方差分析，并利用Duncan检验进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。使用Origin 2021软件进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 BAA提取液的pH值响应性

由图1可以看出，BAA提取液在pH值为1时显示出典型的红色，这是因为黄烊阳离子的存在。在pH 2～6的范围内，由于形成甲醇假碱和酸性羟基，颜色由红色变为粉色。当pH值达到11时，颜色进一步从灰紫色变为深灰色，这可能是由于花青素在弱碱时转变为灰色的醌式碱结构[14]。之后BAA提取液从棕绿色（pH 12）变成棕黄色（pH 13），最后在pH 14条件下变成黄色，这是花青素暴露于碱性条件下被降解所致。

图1 BAA提取物在pH 1～14溶液中的颜色变化Fig. 1 Color change of BAA in the pH range of 1–14

如图2所示，BAA提取液在pH 1条件下的最大吸收峰位于512 nm波长处，此处峰型来源于黄烊阳离子，随着pH值增加至11，BAA的最大吸收峰由512 nm转移至600 nm附近，这些变化主要归因于花青素化学结构的转变[15]，当溶液环境由酸性到碱性变化时，黄烊阳离子形式存在的花色苷逐渐转变为醌型，进而转变为无色假碱，最后在强碱环境中降解。因此，BAA提取液可以指示溶液的弱酸性、中性和碱性，从而可用于监测肉类产品的变质。Carvalho等[16]在从其他植物中提取的花青素中也发现类似现象，证实花青素可以作为pH指示剂添加到薄膜中。

图2 不同缓冲液（pH 1～14）中BAA提取液的紫外-可见光谱Fig. 2 UV-Vis spectra of BAA in the pH range 1–14

2.2 智能指示膜的物理性能分析

如表1所示，随着BAA提取物添加量从0增加到20%，薄膜厚度在40.20～52.30 μm范围内逐渐增加。CS-SA-BAA复合薄膜的厚度显著大于CS-SA薄膜（P＜0.05），表明BAA提取物的添加会影响薄膜的厚度，这是因为花青素含有的羟基与CS、SA形成具有聚合物分子的复杂结构，从而增加了薄膜的厚度。这与Sun Jishuai等[17]将CS与桑椹提取物混合时发现的结果一致。

表1 CS-SA复合薄膜的物理性能Table 1 Physical properties of CS-SA composite films

水分质量分数是评估薄膜在暴露与高水活性食品期间物理完整性的重要指标[19]。如表1所示，与CS-SA膜相比，掺入BAA提取物显著降低了CS-SA复合膜中的水分质量分数（P＜0.05）。表明聚合物中的亲水基团可以与BAA提取物形成氢键，亲水基团将限制聚合物和水分子之间的相互作用，从而形成低水分含量的薄膜。Peralta等[18]发现木槿提取物的添加会显著降低CS复合薄膜含水量（P＜0.05），与本实验研究结果一致。

如表1所示，将BAA提取物掺入复合膜基质后，随添加量从0增加到20%，复合薄膜拉伸强度从24.50 MPa显著增加到42.00 MPa（P＜0.05），这可能是因为BAA提取物含有大量的酚类化合物，其中的羟基可与聚合物形成链之间形成新的氢键，有利于结构的排列和规律性，从而形成了更均匀的薄膜，均质薄膜比非均质薄膜具有更强的机械性能。此外，随着BAA提取物添加量从0增加到20%，断裂伸长率从17.10%显著增加到36.90%（P＜0.05），BAA提取液的润滑和填充会降低聚合物的相互作用，从而增强BAA提取液与聚合物链的自由运动体积与流动性，使其难以断裂，柔韧性增强[19]。Siripatrawan等[20]在与绿茶提取物结合的CS薄膜中也发现了类似的结果。

2.3 智能指示膜的微观结构分析

如图3所示，相比而言，CS-SA薄膜具有最光滑、最均匀的表面和横截面，表明CS、SA和甘油具有良好的相容性。随着BAA提取物添加量的增加，CS-SA-BAA薄膜表面变得不均匀和凸起，这是由于花青素分子和聚合物链之间形成了新的氢键。4 种薄膜的横截面均显示出均匀的线条，表明基质中的聚合物有序排列，具有规则的结构[21]。此外，CS-SA-BAA20薄膜比其他薄膜更为粗糙，且显示出轻微的团聚现象，这可能是因为当BAA提取物达到一定浓度时，提取物在成膜溶液中的溶解度不再增加从而析出。

图3 智能指示膜的表面和横截面的SEM图Fig. 3 Scanning electron microscope micrographs of surface and crosssection of smart indicator film

2.4 智能指示膜的红外光谱分析

如图4所示、BAA提取物在3 595 cm－1（O—H伸缩振动）、2 974 cm－1（CH、烷烃伸缩振动）、1 641 cm－1（C＝C伸缩振动）、1 443 cm－1和1 377 cm－1（—CH3伸缩振动）、1 265 cm－1（C—C伸缩振动）、1 048 cm－1（取代苯）和747cm－1（C—H键从平面外弯曲振动）处出现特征光谱。CS-SA薄膜与CS-SA-BAA复合薄膜显示出相似的红外光谱，4 种薄膜在3 613～3 618 cm－1（O—H伸缩振动），2 959～2 964 cm－1（C—H、烷烃伸缩振动），1 632～1 635 cm－1（C＝C伸缩振动），1 432～1 436 cm－1、1 336～1 341 cm－1（酰胺II带和C－H在平面上弯曲运动），1 167～1 172 cm－1（酰胺III带和C—C伸缩处振动）、751～747 cm－1（C—H键从平面外弯曲振动）处出现特征谱带[22]。考虑到薄膜基质中添加的BAA提取物含量较低，故BAA提取物的添加不会显著改变CS-SA薄膜的特征条带[23]。随着CS-SA薄膜中BAA提取物添加量的增加，智能指示膜的O—H（3 613 cm－1）特征谱带稍微变宽，移至3 617～3 618 cm－1处，这是因为薄膜中的氨基和羟基与BAA提取物中的羟基之间形成氢键诱导所致。此外，酰胺II带和酰胺III带分别从1 432、1 336 cm－1和1 167 cm－1处移至1 434～1 436、1 337～1 341 cm－1和1 168～1 172 cm－1处，酰胺II带和酰胺III带的位移是由于分子间的静电作用。这证实了BAA提取物被成功地固定到CS-SA聚合物中。

图4 智能指示膜的FTIR光谱图Fig. 4 Fourier transform infrared spectra of smart indicator film

2.5 智能指示膜的紫外线透过率分析

在食品贮藏过程中，紫外线会对食品造成损伤，引起新鲜食品的氧化。如图5所示，与CS薄膜相比，BAA的加入大幅降低了CS-BP薄膜的透光率。CS-SA-BAA20薄膜的紫外线透过率在200～300 nm波长处接近于0，这是因为薄膜中的花青素具有吸收紫外光的可能性，当紫外线通过薄膜时，被薄膜折射并散射，从而降低了薄膜的紫外线透过率[24]。因此CS-SA-BAA复合薄膜具有优异的紫外线阻隔率，同时，CS-SA-BAA复合薄膜紫外线透过率低于CS-SA膜，说明CS-SA-BAA复合膜降低了CS-SA薄膜的紫外线透过率，使薄膜拥有了更好的紫外线阻隔性能。Choi等[25]在使用琼脂/马铃薯淀粉和紫甘薯花青素制备智能包装材料时也得出了相似结论。

图5 智能指示膜的紫外-可见光谱图Fig. 5 UV-Vis spectra of smart indicator film

2.6 智能指示膜的pH值智能指示分析

CS-SA薄膜不含有BAA提取物，因此薄膜几乎是透明的。如表2所示，随着BAA提取物添加量的增加，L*值显著降低（P＜0.05），a*值、b*值和ΔE值均显著增加（P＜0.05），薄膜的ΔE值反映颜色视觉感知的情况，Mohammadalinejhad等[26]的研究表明，当ΔE值高于5时，薄膜的颜色随着环境中pH值的变化而变化，肉眼可以直接区分薄膜的颜色不同。这表明CS-SA-BAA薄膜可以通过肉眼容易分辨，并且可以用作智能指示膜。

表2 CS-SA复合膜的颜色参数L*、a*、b*和ΔE值Table 2 Color parameters L*, a*, b*, and ΔE of CS-SA composite films

由图6可知，没有花青素的CS-SA薄膜在pH 1～14的缓冲液中没有明显的颜色差异。相比之下，CS-SA-BAA复合薄膜显示出pH值敏感性，并且在不同的缓冲液中表现出可视的颜色变化，这归因于花青素的结构转变[25]。在不同pH值溶液中，CS-SA-BAA15薄膜的颜色变化比CS-SA-BAA10和CS-SA-BAA20薄膜的颜色变化更明显。少量的花青素不足以表现出明显的颜色变化，而过量的花青素会引起花青素本身颜色的干扰[27]。Yong Huimin等[14]也报道了含有15%紫甘薯花青素的聚合物薄膜有利于监测食品新鲜度。CS-SA-BAA复合膜的颜色变化也是由于酸性溶液中的阳离子在pH值变为碱性后结构发生了转变。Jiang Guangyang等[28]报道了富含花青素的薄膜中的类似颜色变化。由于虾的腐败与pH值变化密切相关，且CS-SA-BAA15薄膜在不同pH值溶液中的颜色变化更明显，故选择CS-SA-BAA15薄膜作为智能指示膜用于监测虾的新鲜度。

图6 在pH 1～14溶液中浸泡5 min后CS-SA-BAA复合膜的颜色Fig. 6 Color response of CS-SA-BAA composite films after exposure pH 1–14 for 5 min

2.7 智能指示膜在虾保鲜中的应用

CS-SA-BAA15智能指示膜指示剂标签设计及在虾贮藏期间薄膜颜色变化如图7所示。虾的腐败主要是由于微生物及其生化反应所致。贮藏过程中微生物代谢产生的各种挥发性气体从虾中缓慢释放到保鲜盒的顶部空间，然后这些成分在盒子顶部空间积累，并被放置在虾肉上的CS-SA-BAA15薄膜吸收，使薄膜花青素结构发生改变[29]。因此，pH值与TVB-N含量的增加会影响CS-SA-BAA15薄膜的颜色，pH值和TVB-N含量与微生物的生长繁殖密切相关，通常是用作评价水产品新鲜度的重要指标[30]。

如图8所示，随着贮藏时间的延长，虾的pH值呈现出先下降后上升的趋势，pH值下降的主要原因是虾体停止呼吸后虾体内的糖原降解产生乳酸，同时ATP分解产生磷酸，这些酸性物质的积累导致虾的pH值下降[31]；而当虾进入自溶腐败阶段时，虾体内的蛋白质、氨基酸等物质会在蛋白酶和一些碱性微生物的作用下分解成氨类、二甲胺等挥发性含氮物质，导致虾pH值升高[32]。而虾TVB-N含量则随着贮藏时间的延长而升高。TVB-N含量可作为水产品鲜度的评价指标，根据其含量可将鲜度等级划分为一级鲜度（＜15 mg/100 g）、二级鲜度（15～20 mg/100 g）、三级鲜度（20～30 mg/100 g）和完全腐败（＞30 mg/100 g）[33]。当pH值超过7.7时认为虾体已完全腐败变质[34]。新鲜虾TVB-N含量为8.85 mg/100 g，新鲜虾的pH值为7.07，智能指示膜CS-SA-BAA15的初始颜色呈现紫色，贮藏的第4天，CS-SA-BAA15薄膜颜色显示为浅灰色，其TVB-N含量为26.7 mg/100 g，即开始变质，pH值为7.49，低于腐败标准，对应三级鲜度。贮藏第5天时，CS-SA-BAA15薄膜颜色显示为深灰色，此时TVB-N含量为32.5 mg/100 g，pH值为7.77，TVB-N含量和pH值均达到腐败值，故认为腐败不能食用，在贮藏的第6天时，智能指示膜变为黄棕色，对应TVB-N含量和pH值均已超过腐败标准，盒子里的虾有明显的腥臭味和氨味，且虾的色泽暗淡、变黄，表明虾完全腐败。综上所述，将4 ℃贮藏过程中的虾新鲜度划分为3 个等级：0～1 d为一级鲜度（紫色）；2 d为二级鲜度（浅粉色）；3～4 d为三级鲜度（深粉色、浅灰色）；5～6 d完全腐败（深灰色、浅棕色）。

图8 虾在4 ℃贮存6 d过程中的TVB-N含量和pH值变化Fig. 8 Changes in TVB-N content and pH of shrimp meat during storage at 4 ℃ for six days

如表3所示，随着贮藏时间的延长，L*值逐渐下降，a*值、b*值和ΔE呈现上升趋势，其变化与指示膜的pH值响应行为一致。差异显著性分析表明，不同新鲜度的虾L*、a*、b*值和ΔE在具有显著差异（P＜0.05），证实利用指示膜颜色对虾鲜度进行区分具有可行性。

表3 指示膜应用于虾鲜度监测时的颜色变化Table 3 Color changes of indicator films in response to shrimp freshness

如图9所示，CS-SA-BAA15薄膜的ΔE与虾样品的pH值和TVB-N含量呈正相关。此外，ΔE与pH值（0.862）、TVB-N含量（0.974）拟合曲线方程的决定系数R2较高。由图10可看出，ΔE与TVB-N含量（r＝0.99，P＜0.01）、pH值（r＝0.93，P＜0.01）呈极显著正相关。以上结果说明，针对于虾的不同新鲜度，CS-SABAA15薄膜可显示出明显的颜色变化，可以将其应用于虾贮存期的新鲜度监测。

图10 在4 ℃下贮存期间虾的TVB-N含量、pH值、L*、a*、b*和ΔE之间的皮尔森相关系数Fig. 10 Pearson’s correlation coefficients among TVB-N content, pH,L*, a*, b* and ΔE values of shrimp during storage at 4 ℃

3 结 论

本实验利用CS-SA-BAA复合薄膜和BAA提取物制备了用于虾新鲜度指示的智能传感比色膜。结果表明：BAA被成功复合到CS-SA薄膜上，且与CS-SA薄膜之间形成新的相互作用。CA-SA-BAA复合膜比CS-SA薄膜具有更好的机械性能和紫外线阻隔性能。随着BAA提取物添加量的增加，薄膜颜色L*值显著下降，a*、b*值和ΔE显著上升。此外，CS-SA-BAA薄膜能在不同的pH值缓冲液中显示出明显的颜色差异，将CS-SA-BAA15薄膜作为智能指示膜在虾保鲜上进行应用，结果表明，虾新鲜度为一级鲜度时（0～1 d）指示膜为紫色；二级鲜度（2 d）时指示膜为浅粉色；三级鲜度时（3～4 d）指示膜为深粉色转浅灰色；腐败时（5～6 d）指示膜为深灰色或黄棕色。因此CS-SA-BAA15薄膜的颜色变化可以反映虾的实时新鲜度变化情况，这表明CS-SA-BAA15复合薄膜可作为智能指示膜实时监测虾的新鲜度。