欧李果浆对失眠小鼠的改善作用及机制

傅 娆，梁 哲，温 馨，倪元颖

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，国家果蔬加工工程技术研究中心，农业农村部果蔬加工重点实验室，北京 100083）

在现代社会，入睡困难、焦虑不安、慢性失眠等一系列睡眠问题的发生率逐渐升高。失眠症的治疗方法包括心理治疗、药物治疗、物理治疗和综合治疗等，其中药物治疗主要包含γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric，GABA）复合体激动药、镇静类抗抑郁药、选择性褪黑素受体激动药、抗组胺药等[1-2]。GABA是存在于蔬菜、水果以及发酵食品中的一种非蛋白质氨基酸，也是一种常见的促进睡眠的活性物质。在哺乳动物中，谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的作用下产生GABA，其在中枢神经系统中发挥抑制神经递质的作用[3]。Yamatsu等[4]利用一项随机、单盲、安慰剂对照的交叉设计研究评估了GABA对睡眠的影响，发现GABA显著缩短了睡眠潜伏期，并延长了非快速眼动睡眠时间。Abdou等[5]以水或L-茶氨酸为对照进行脑电图测试，13 名受试者服用GABA 1 h后，α波增加，β波减少，表明GABA有利于大脑的镇静。Okada等[6]在对20 名更年期女性的研究中发现，每日服用含有26.4 mg GABA的脱脂大米胚芽后，超过65%的受试者睡眠质量得到改善，且更年期的抑郁情绪得到缓解。由于GABA功能性活性较强，利用富含GABA的膳食补充剂（如红茶[7]、罗布麻叶[8]、酸枣仁[9]、发酵乳制品[10]、发芽糙米[11]等）辅助改善睡眠的研究近年来多有报道。

欧李（Cerasus humilis(Bge.) Sok）为我国特有的具有耐贫瘠、抗旱、抗寒、适应性强等特性的植物[12]，主要种植于山西、内蒙古、辽宁、河南、河北等干旱寒冷省份[13]。欧李果实富含糖类、蛋白质、矿物质、维生素、氨基酸等营养物质，总糖相对含量为5.33%，有机酸相对含量为1.29%，与桃、杏、李等核果类相比，其总糖含量较低、有机酸含量较高[14-15]。Liu Suwen等[16]对7 种欧李进行评价，结果显示欧李果实含有丰富的酚类物质，其含量达339.07～770.30 mg/100 g（以鲜质量计）。王亚君[17]采用超声乙醇辅助提取欧李果实总黄酮，总黄酮提取量可达51.39 mg/g（以干质量计）。目前，研究者对可鲜食欧李的研究多集中于营养成分的分析与测定，对于其功能性的相关研究鲜有报道。本研究选用北京地区3 种常见的可鲜食欧李品种，聚焦于欧李果实中具有助睡眠功效的GABA等成分。同时，选取经过体外模拟消化后GABA含量较高的欧李品种进行急性毒理学实验，评价其果浆的安全性，参照《保健食品检验与评价技术规范（2023年版）》中的方法探究欧李果浆的助眠效果，并初步探究欧李果浆的助眠机理，为欧李果实深加工及功能食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、动物与试剂

‘农大7号’欧李与‘燕山2号’欧李均采摘自北京市平谷区东高村镇南宅庄户村；‘农大4号’欧李购自河北省张家口市崇礼区石窑子乡堡东沟村。3 种欧李均为2019年8月下旬的成熟期果实，去除烂果、果柄、枝叶、果核后，将果肉研磨成浆，－20 ℃冷冻备用。

230 只6 周龄ICR雄性小鼠（SPF级）购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2019-0010，伦理审查编号：20200007YFA-3R。5 只一笼，分笼饲养于SPF级动物实验室，饲养环境为温度（23±3）℃、相对湿度（55±15）%。

淀粉酶、唾液淀粉酶、猪胃蛋白酶、胰酶、猪胆盐西格玛奥德里奇（上海）贸易有有限公司；戊巴比妥钠、地西泮 国药集团化学试剂有限公司；5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、GABA、白细胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、促肾上腺皮质激素（adrenocor ticotropic hormone，ACTH）、皮质酮（corticosterone，CORT）酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 武汉纯度生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

AL104分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DR-200BS酶标分析仪 无锡华卫德朗仪器有限公司；A6半自动生化仪 北京松上技术有限公司；Neofuge 13R低温冷冻离心机 香港力康生物医疗科技控股有限公司；Wonbio-96c多样品冷冻研磨仪 上海万柏生物科技有限公司；8890B-5977B气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 欧李果浆中理化指标和活性成分的测定

参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中的方法测定水分质量分数。参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》中的方法测定灰分含量。参照NY/T 2637—2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的测定 折射仪法》中的方法测定可溶性固形物含量。参照SN/T 4592—2016《出口食品中总黄酮的测定》中的方法测定黄酮含量。参照DB12/T 885—2019《植物提取物中原花青素的测定紫外/可见分光光度法》中的方法测定花青素含量。参照T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中总多酚含量的测定 分光光度法》中的方法测定多酚含量。

参考NY/T 2890—2016《稻米中γ-氨基丁酸的测定 高效液相色谱法》中的方法并进行部分修改，测定样品中的GABA含量。欧李果肉经研磨后，过60 目筛备用。称取1.0 g样品加入10 mL提取液（V（无水乙醇）∶V（水）＝4∶1），超声提取10 min，5 000 r/min离心5 min，重复一次提取后合并上清液，使用提取液定容至25 mL。准确称取衍生化试剂4-二甲基氨基偶氮苯-4-磺酰氯20.0 mg，使用乙腈溶解并定容至10 mL，现配现用。将1 mL试样溶液或GABA标准工作液加入0.20 mL碳酸氢钠溶液后再加入0.40 mL衍生化试剂。置于70 ℃水浴锅内衍生化20 min，取出后混匀过0.45 μm水相滤膜后待测。高效液相色谱条件：C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；检测波长为436 nm；柱温为30 ℃；进样量10 μL；流动相A为无水乙腈，流动相B为三水合乙酸钠溶液，等度洗脱（流动相A、B体积比为35∶65），流速为1.0 mL/min。采用外标法测定GABA含量。

1.3.2 欧李果浆的体外模拟消化

参考Minekus等[18]的方法，配制模拟唾液（simulated salivary fluid，SSF）、模拟胃液（simulated gastric fluid，SGF）以及模拟肠液（simulated intestinal fluid，SIF）。称取5 g欧李果浆加入3 mL SSF、1 mLα-唾液淀粉酶以及25 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液，37 ℃反应2 min。调节样品至pH 3.0，加入6 mL SGF，准确添加2 mL猪胃蛋白酶溶液及0.3 mol/L CaCl2溶液5 μL，氮吹处理10 s后封盖，37 ℃反应2 h。调节样品至pH 6.0，准确添加5 mL 80 mmol/L牛胆盐溶液、10 mL胰酶以及40 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液，再次调节样品至pH 7.0，氮吹处理10 s后封盖，37 ℃反应2 h，使用液氮进行冷冻灭酶处理。上述各阶段样品均加去离子水定容至50 mL，5 000 r/min离心3 min，收集上清液，采用超声功率350 W提取10 min，70 ℃条件下减压浓缩回收至20 mL，使用去离子水定容至25 mL得到样品溶液。采用1.3.1节的方法进行GABA含量的测定。

1.3.3 欧李果浆急性经口毒性分析

将小鼠分为雌雄两组，参照GB 15193.3—2014《食品安全国家标准 急性经口毒性试验》中的方法，采用限量法进行欧李果浆的急性经口毒性试验。记录实验期间小鼠体质量及死亡数量。

1.3.4 欧李果浆助睡眠功能分析

1.3.4.1 动物饲养及分组

饲养环境：不限制饮食饮水，适应性喂养1 周。适应性喂养结束后，将小鼠参照体质量随机分为5 组，每组40 只，所用饲料均为普通饲料，小鼠分组及灌胃处理情况见表1。参考文献[19-20]，根据GABA等成分含量设置阳性对照组和欧李果浆低、中、高剂量组。

表1 实验设计及动物分组Table 1 Experimental design and animal grouping

灌胃受试物配制：1）欧李果浆：分别称取2、4、8 g欧李果浆，用生理盐水稀释定容至100 mL，每次灌胃前充分混匀。2）地西泮：取30 mg地西泮药片研磨成粉末，用生理盐水溶解定容至100 mL，储存于4 ℃。小鼠经口灌胃10 mL/（kgmb·d）的生理盐水、地西泮溶液或不同质量浓度的欧李果浆，连续灌胃30 d。

1.3.4.2 高架十字迷宫实验

参照陈文等[21]的方法，高架十字迷宫硬件由开放臂与封闭臂组成，2 条开放臂（长×宽＝30 cm×5 cm）相对组装、2 条封闭臂（长×宽×高＝30 cm×5 cm×15 cm）相对组装。开放臂与封闭臂交叉垂直安装在中央平台（5 cm×5 cm）上。摄像机安置于中央平台垂直上方，记录小鼠在装置中的运动情况，整个装置放置在距地50 cm的高度。实验在安静、无干扰的环境下进行，使用摄像机记录5 min内小鼠进入开放臂或封闭臂的次数和停留时间。

1.3.4.3 直接睡眠实验和戊巴比妥钠睡眠时间延长实验

参照文献[22]的方法以及《保健食品检验与评价技术规范（2023版）》中改善睡眠功能评价规范部分进行改善睡眠功能实验。各组小鼠连续30 d每天上午灌胃1 次，灌胃体积10 mL/（kgmb·d）。灌胃至第29天时称质量并观察各组小鼠是否出现直接睡眠现象。第30天，小鼠末次灌胃30 min后，给每只小鼠腹腔注射戊巴比妥钠诱导睡眠，注射量为10 mL/（kgmb·d）。翻正反射消失记为睡眠开始，小鼠恢复翻正反射记为睡眠截止，记录小鼠睡眠时间，观察各组小鼠戊巴比妥钠诱导睡眠时间是否延长。

1.3.4.4 戊巴比妥钠阈下剂量实验

小鼠第30天末次灌胃给药30 min后腹腔注射10 mL/（kgmb·d）的戊巴比妥钠（预实验的最佳剂量）。小鼠翻正反射消失超过1 min认为入睡成功，记录在30 min内入睡小鼠数量，按下式计算睡眠率。

1.3.4.5 巴比妥钠睡眠潜伏期实验

小鼠第30天末次灌胃给药30 min后腹腔注射10 mL/（kgmb·d）的巴比妥钠。腹腔注射巴比妥钠后至翻正反射消失的时间即为小鼠睡眠潜伏期。观察并记录各组小鼠巴比妥钠睡眠潜伏期时长。

1.3.4.6 小鼠血清及大脑中相关生化指标的测定

小鼠饲养至第29天，灌胃结束4 h后采集戊巴比妥钠阈下剂量实验组小鼠血清。其血清中GABA浓度采用比色法测定。分别在对照管、标准管与样本管中加入受试物小鼠血清与试剂，100 ℃水浴锅中反应5 min，室温下放置5 min，在645 nm波长处进行吸光度测定。血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、ACTH、CORT质量浓度使用ELISA试剂盒进行测定。

小鼠延长戊巴比妥钠睡眠时间实验结束后，继续分组灌胃饲养14 d，采集小鼠大脑。其大脑中GABA、5-HT含量采用双抗体一步夹心法ELISA检测。

1.4 数据处理及分析

实验数据采用SPSS 22.0软件进行分析，以平均值±标准差表示，采用Origin 8.6软件作图。采用单因素方差分析进行组间差异性检验，以P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 3 种欧李果浆中理化成分及辅助助眠功能物质含量分析

不同品种欧李的加工适宜性有所差别，为选择适合加工果浆的品种，本研究对3 个品种欧李的水分质量分数、灰分以及可溶性固形物含量进行测定。结果发现，‘农大4号’‘农大7号’和‘燕山2号’欧李果实的水分含量分别为85.6、88.2、90.2 g/100 g，灰分含量分别为0.69、0.38、0.27 g/100 g，可溶性固形物含量分别为12.8、9.8、4.8 g/100 g。‘农大4号’欧李是水分含量最低、灰分及可溶性固形物含量最高的品种，最适合作为原料加工成欧李果浆。

‘农大4号’‘农大7号’和‘燕山2号’欧李果浆中总黄酮的含量分别为4 467.6、2 213.3 mg/kg和2 540.7 mg/kg，其中‘农大4号’欧李果浆中总黄酮含量最高。3 种欧李果浆中总酚含量差异较大，其中‘农大4号’欧李果浆中多酚含量高达4 584.87 mg/kg，‘农大7号’和‘燕山2号’分别为2 578.9 mg/kg和2 654.4 mg/kg。黄酮可以通过调节抑制性神经递质如5-HT、GABA、前列腺素等发挥镇静催眠作用，并有助于改善睡眠质量[23]。膳食中摄入的多酚能够通过调节成人海马体神经形成的方式在一定程度上改善焦虑水平[24]。焦虑水平的改善有助于睡眠质量的改善，因此黄酮和多酚成分可能是欧李果浆中能够辅助睡眠的潜在物质。

2.2 不同品种欧李果浆消化前后GABA的含量

通过对3 种新鲜欧李果实中GABA含量的测定结果发现，‘农大4号’欧李果实中GABA的含量最高，达到118.34 mg/kg，高于‘农大7号’（80.26 mg/kg）和‘燕山2号’（92.72 mg/kg）。蔡愈杭等[25]采用邻苯二甲醛柱前衍生高效液相色谱法对河北地区欧李果实中GABA的含量进行测定，发现其平均含量为140 mg/kg（以鲜质量计）。董姊怡等[26]测定‘京欧2号’欧李果实不同部位的GABA含量，发现其果肉中的GABA含量为406.7 mg/kg（以干质量计），不同欧李果实中GABA含量的差异可能与品种及样品干燥工艺有关。

GABA作为一种非蛋白质氨基酸会强烈影响睡眠的早期阶段，这可能与其在血液中的水平相关，因此GABA含量高的食物进入消化道后能否被吸收利用需要进行进一步的评估。3 种欧李果浆在体外模拟消化前以及体外模拟口腔、胃、肠道消化结束后上清液中GABA的含量如表2所示。

表2 3 种欧李果浆体外模拟消化液上清液中GABA的含量Table 2 GABA contents of in vitro digestion supernatants of Chinese dwarf cherry pulp from three cultivars mg/kg

由表2可知，随着模拟消化的进行，样品中的GABA含量逐渐增加。其中口相和胃相模拟消化阶段结束后，与消化前相比，上清液中GABA的含量无明显变化，说明在口腔和胃部的消化过程中GABA依然存在于欧李果肉组织内，未释放至果浆上清液中，GABA溶出的程度较低。而进入肠道进行消化后，欧李果肉细胞结构进一步被破坏，GABA大量溶出，上清液中的GABA含量显著增加。‘农大4号’欧李果浆在各个模拟消化阶段的GABA含量均显著高于其他两个品种（P＜0.05）。结合2.1节营养物质含量测定的结果，‘农大4号’果肉总黄酮、多酚2 个与辅助睡眠功能相关的营养素含量均高于另外两个品种，因此后续实验选取‘农大4号’欧李作为研究对象。

2.3 欧李果浆的小鼠急性毒性实验

经肉眼观察，雌雄两组受试小鼠灌胃给药后4 h内状态无明显异常，14 d内活动情况无异常，实验第14天时小鼠均存活，肉眼观察经过解剖后的小鼠各脏器及肠道均无异常。实验期间小鼠体质量变化如表3所示。根据GB 15193.3—2014中的判定要求，证明欧李果浆无急性毒性。

表3 急性毒理实验期间小鼠体质量变化Table 3 Changes in mice body mass during acute toxicological experiments

2.4 欧李果浆对小鼠焦虑情况的缓解作用

高架十字迷宫实验以实验动物对于开放、高悬、无保护环境的恐惧以及啮齿类动物对黑暗环境的趋向性，形成“探究-规避”的行为冲突，这一行为实验可以模拟人类的焦虑状态[26]。心理焦虑水平高的小鼠会倾向于进入封闭臂以寻求保护，因此，比较各组小鼠在高架十字迷宫内前往开放臂与封闭臂的次数及停留时间，能够检测经口灌胃欧李果浆是否会影响小鼠的焦虑水平。阳性对照组选用的3 mg/kgmb地西泮溶液是一种临床常见的镇静催眠类药物。如图1所示，与空白对照组相比，欧李果浆低剂量组和中剂量组小鼠进入开放臂的次数以及在开放臂中停留的时间均无显著差异，表明其焦虑状况没有得到缓解；而欧李果浆高剂量组与阳性对照组小鼠进入开放臂次数显著增多，在开放臂中停留的时间显著延长（P＜0.05，P＜0.01），表现出对陌生环境的探索欲望，表明小鼠的焦虑水平较低。赵志恒[27]对小鼠灌胃从甘草、大枣、枸杞、桑叶、黄芪、金银花中提取的黄酮、多酚和豆甾醇混合物，进而观察其空间自主活动行为，发现8.84 g/（kgmb·d）的剂量具有较好的抗抑郁、抗焦虑效果，本研究结果与之类似。Liu Huan等[28]研究了GABA对邻苯二甲酸二酯诱导大鼠焦虑行为的影响，发现GABA降低了大鼠前额叶皮层一氧化氮水平和一氧化氮合酶活力，露天测试和迷宫测试结果表明其缓解了大鼠的焦虑行为。

2.5 欧李果浆对小鼠睡眠功能的改善作用

2.5.1 直接睡眠实验结果

表4表明，灌胃无菌生理盐水、不同剂量欧李果浆及地西泮后，在1 h内各组小鼠均未失去翻正反射，且能够正常活动，证明生理盐水、欧李果浆以及地西泮对小鼠均无直接催眠作用。

表4 不同剂量欧李果浆对小鼠直接睡眠的影响Table 4 Effects of varied doses of Chinese dwarf cherry pulp on immediate sleep of mice

2.5.2 戊巴比妥钠睡眠时间延长实验结果

通过预实验，确定使全部小鼠入睡且睡眠持续时间适中的戊巴比妥钠腹腔注射剂量为41 mg/kgmb。如图2所示，与空白对照组相比，欧李果浆低剂量组和中剂量组未能延长小鼠戊巴比妥钠诱导的睡眠持续时间，而欧李果浆高剂量组能够显著延长小鼠戊巴比妥钠诱导的睡眠持续时间（P＜0.05），阳性对照组小鼠戊巴比妥钠诱导的睡眠持续时间得到了极显著延长（P＜0.01）。本研究结果与0.83 g/kg毛叶茶GABA提取物对小鼠睡眠时间延长的结果[29]一致，Yu Leilei等[30]在对雄性ICR小鼠灌胃33.33 mg/kgmb的GABA发酵乳的研究中也观察到了类似的结果。

图2 不同剂量欧李果浆对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠持续时间的影响Fig. 2 Effects of varied doses of Chinese dwarf cherry pulp on pentobarbital-induced sleep duration in mice

2.5.3 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验结果

戊巴比妥钠在机体内通过肝酶代谢途径排出体外，因此需要进行戊巴比妥钠阈下剂量实验，从而排除欧李果浆通过抑制肝酶活力来延长戊巴比妥钠睡眠时间的可能性。通过预实验，确定戊巴比妥钠的注射剂量为28 mg/kgmb。如表5所示，腹腔注射戊巴比妥钠后，空白对照组与欧李果浆低剂量组小鼠在1 h内未进入睡眠状态，而欧李果浆中剂量组有1 只小鼠在1 h内进入睡眠，入睡率10%；欧李果浆高剂量组有2 只小鼠在1 h内进入睡眠，入睡率20%，与空白对照组相比入睡率有所升高，但无显著性差异。阳性对照组小鼠则在1 h内全部进入睡眠，与空白对照组相比差异极显著（P＜0.01）。有研究表明，3.33 g/kg的毛叶茶GABA提取物可将戊巴比妥钠（37.75 mg/kg）阈下剂量诱导小鼠的睡眠率提高至25%[29]，本研究中欧李果浆高剂量组小鼠表现出相似的效果，这可能与GABA能系统介导促睡眠作用有关。

表5 各剂量欧李果浆对戊巴比妥钠阈下剂量入睡率的影响Table 5 Effects of varied doses of Chinese dwarf cherry pulp on sleep rate induced by sodium pentobarbital at subthreshold dose

2.5.4 巴比妥钠睡眠潜伏期实验结果

为小鼠进行巴比妥钠腹腔注射，观察小鼠巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期，若睡眠潜伏期缩短，小鼠入睡更快，则证明受试物能够和巴比妥钠发生协同作用。在预实验中，确定巴比妥钠的注射量为300 mg/kgmb。如图3所示，与空白对照组相比，灌胃地西泮的阳性对照组小鼠巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期极显著缩短（P＜0.01），欧李果浆高剂量组小鼠睡眠潜伏期也显著缩短（P＜0.05），但中剂量和低剂量欧李果浆对巴比妥钠诱导睡眠潜伏期的影响不显著。这与已有的助眠食品对睡眠潜伏期的相关报道一致，如冯艳钰等[31]使用25 mL/kg红参-燕窝-酸枣仁复合助眠饮料可将小鼠睡眠潜伏期缩短14.37 min。

图3 不同剂量欧李果浆对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响Fig. 3 Effects of varied doses of Chinese dwarf cherry pulp on the sleeping incubation period induced by barbital sodium

根据《保健食品检验与评价技术规范（2023版）》中对改善睡眠功能结果的判定中，延长戊巴比妥钠睡眠实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验以及巴比妥钠睡眠潜伏期实验这3 个实验中，若有两项实验结果为阳性，且无明显直接诱导睡眠作用，则认为受试物具有改善睡眠功能的作用。因此，高剂量欧李果浆可被判定为具有改善睡眠功能的作用。韩啸[32]对16.67 mg/kgmb的GABA溶液的辅助睡眠作用进行了研究，结果显示GABA在戊巴比妥钠睡眠延长实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验以及巴比妥钠睡眠潜伏期实验中比空白组有效，但效果不显著。而本研究中高剂量欧李果浆灌胃具有改善睡眠功能的作用，这可能与欧李果浆中GABA及其他助眠成分的协同作用有关。

2.5.5 小鼠血清成分分析

为探究连续30 d灌胃欧李果浆对小鼠血清指标的影响，本实验研究小鼠血清指标是否与小鼠睡眠情况相关，分别对小鼠血清内GABA浓度及CORT、TNF-α、ACTH、IL-1β、IL-6质量浓度进行测定，结果如表6、7所示。

表6 不同剂量欧李果浆对小鼠血清中CORT和ACTH质量浓度的影响Table 6 Effects of different doses of Chinese dwarf cherry pulp on CORT and ACTH concentrations in mice serum

表7 不同剂量欧李果浆对小鼠血清中GABA浓度及IL-1β、IL-6、TNF-α质量浓度的影响Table 7 Effects of different doses of Chinese dwarf cherry pulp on GABA, IL-1β, IL-6 and TNF-α concentrations in mice serum

CORT作为一种应激性激素，是下丘脑-垂体-肾上腺（the hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）轴的终产物之一，与人体代谢作用关系密切。ACTH是由垂体前叶分泌的一种激素，能够调节糖皮质激素的分泌，在神经内分泌网络中发挥作用。Suchecki等[33]的研究表明不同方式的睡眠剥夺实验均会导致大鼠血清中ACTH和CORT含量的提升。Gillin等[34]的实验证明对健康志愿者静脉注射ACTH会缩短睡眠时间，尤其是快速动眼睡眠时间。

如表6所示，随着灌胃欧李果浆剂量的升高，小鼠血清内的CORT和ACTH质量浓度逐渐降低，且除欧李果浆低剂量组与空白对照组间ACTH质量浓度没有显著性差异外，其余各组间均差异显著（P＜0.05）。在本研究中，灌胃欧李果浆能够降低血浆中CORT和ACTH水平，证明其具有改善睡眠功能的作用，其可能是通过抑制HPA轴过度兴奋和应激状态，调整相关激素的分泌产生作用。

血清中GABA浓度与欧李果浆灌胃剂量无线性相关性，这可能是因为血清中GABA的浓度是动态变化的。有研究表明小鼠摄入GABA 30 min后GABA在血清中的浓度最高，随后会逐渐代谢分解[35]。另一方面，GABA可以由谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸脱羧产生，其在生物体中存在两种合成途径。一种是通过精氨酸和精氨代谢通路，另一种则起源于三羧酸循环中的α-酮戊二酸经由谷氨酸脱氢酶催化得到谷氨酸，进而脱羧形成GABA[36]。Suvajit等[37]对静脉血中GABA的循环水平进行监测，发现当谷氨酸被转移到内皮细胞后，GABA能够被部分保留，且胰腺细胞、肾上腺细胞和部分免疫细胞都可能是血液循环中GABA的重要来源。因此，本研究中血清GABA浓度的波动可能与小鼠体内多种合成与分解代谢相关。

欧李果浆低剂量组与空白对照组的IL-1β、IL-6质量浓度之间无显著性差异（P＜0.05），但随着欧李果浆灌胃剂量的增加，IL-1β、IL-6、TNF-α质量浓度均显著降低（P＜0.05），阳性对照组小鼠上述3 个指标的降低效果最明显，且与欧李高剂量组具有显著性差异（P＜0.05）。Irwin等[38]对睡眠障碍、睡眠时间和炎症关系进行荟萃分析发现，睡眠障碍与炎症因子水平的增长有关。Haack等[39]的研究显示长期睡眠剥夺会造成免疫细胞数量增加，从而引起IL-1β、IL-6、TNF-α等与睡眠相关的促炎细胞因子和炎症标记物水平升高，导致炎症反应。而灌胃欧李果浆能够显著降低小鼠血清内的炎症因子质量浓度，因此，欧李果浆改善睡眠功能的作用可能与降低炎症因子含量和体内炎症应激水平有关。

2.5.6 小鼠大脑中GABA和5-HT含量

上述实验表明灌胃高剂量欧李果浆组小鼠改善睡眠功能效果最明显，因此，在继续饲养14 d后，对空白对照组、欧李果浆高剂量组和阳性对照组的小鼠大脑内GABA和5-HT含量进行测定，结果如表8所示。

表8 高剂量欧李果浆对小鼠大脑中GABA和5-HT含量的影响Table 8 Effects of high dose of Chinese dwarf cherry pulp on GABA and 5-HT contents in mice brain

大脑中GABA含量的降低可能与抑郁症、帕金森病、焦虑症等精神疾病的发生相关[40]。5-HT是一种单胺类神经递质，其可通过作用于特异的5-HT1A受体相关信号通路实现对小鼠行为学的改善[41]。欧李果浆高剂量组和阳性对照组小鼠大脑内GABA和5-HT含量与空白对照组之间差异不显著，但欧李果浆高剂量组与阳性对照组小鼠大脑内GABA含量的改变量略有不同，这可能是因为脑组织中各部位GABA水平差别很大，其中黑质和苍白球中含量最高（大于9 μmol/g），下丘脑次之[42]，这可能是GABA在不同大脑区域的转移引起的[43]。本研究中小鼠脑组织整体取样可能会造成GABA含量的波动。GABA及其受体虽然具有调节睡眠的功能，但通常与大脑中去甲肾上腺素、褪黑素和谷氨酸等其他神经递质共同发生作用，维持睡眠-觉醒功能[44]，后期可对大脑中海马体、下丘脑等区域的神经递质进行研究。

3 结 论

‘农大4号’欧李果实中总黄酮、多酚及GABA含量均高于其他品种，体外模拟消化实验结果表明，‘农大4号’欧李果浆释放于消化液上清液中的GABA含量最高。高架十字迷宫实验结果显示，以800 mg/kgmb剂量灌胃欧李果浆能够显著改善小鼠焦虑水平。欧李果浆高剂量组小鼠在戊巴比妥钠睡眠延长实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验以及巴比妥钠睡眠潜伏期实验中，戊巴比妥钠睡眠延长实验和巴比妥钠睡眠潜伏期实验的结果为阳性，且无明显的直接催眠作用，可判定800 mg/kgmb剂量欧李果浆灌胃具有改善小鼠睡眠功能的作用。高剂量欧李果浆对睡眠功能的改善可能是通过抑制HPA轴兴奋，调节该途径中ACTH、CORT等激素质量浓度，同时降低血清内免疫因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）质量浓度，从而发挥减轻小鼠焦虑、辅助睡眠的作用。本研究结果初步探讨了欧李果浆发挥助眠功能的机制，为新资源欧李产品的开发与应用提供了新思路。