重组禽流感病毒细胞源灭活疫苗灭活工艺的研究及应用

杜 鑫，付春杰，苏 操，孟令伟，石 莹，张 丹，曲艳娇，宋海岩，朱长动，杨 柳

吉林冠界生物技术有限公司，吉林梅河口 135000

禽流感是引起水禽、野禽、家禽的一种急性高度接触性传染病，我国将其列为一类疫病[1,2]。防控禽流感的重要途径是疫苗免疫，灭活疫苗不仅要求能够产生高水平的抗体，还应具备安全性良好，无不良反应，因此生产安全高效的灭活疫苗意义重大。灭活是疫苗生产的关键环节，灭活效果与灭活剂的选择密切相关，理想的灭活剂不但免疫原性良好，且无任何毒副作用[3]。

本试验用β-丙内酯、甲醛、二乙烯亚胺、N-乙酰乙烯亚胺、盐酸聚六亚甲基胍灭活剂对重组禽流感病毒细胞毒的灭活效果进行了研究，确定了不同灭活剂的灭活的最佳条件并配苗，比较其免疫效果和安全性，筛选出了安全、高效的重组禽流感病毒细胞源灭活疫苗用灭活剂。

1 材料

1.1 病毒液

重组禽流感病毒H5 亚型Re-13 株、Re-14 株和重组禽流感病毒H7 亚型H7-Re4 株细胞毒(浓缩后HA 效价均为9log2)由吉林冠界生物技术有限公司生产。

1.2 抗原、血清

禽流感病毒H5 亚型H5-Re13 株、H5-Re14 株和H7 亚型H7-Re4 株血凝抑制试验抗原和阳性血清，购自哈尔滨维科生物技术有限公司。

1.3 SPF 鸡胚和SPF 鸡

购自北京勃林格生物。

2 方法

2.1 病毒的灭活

2.1.1 甲醛灭活最佳条件：在病毒液中缓慢滴加40%的甲醛溶液，使终浓度分别为 0.2%、0.15%、0.1%、0.05%、0.025%，37 ℃ 130 r/min 灭活，作用至32 h，每隔8 h 取样。

2.1.2 β-丙内酯灭活最佳条件：在病毒液中缓慢滴加稀释后β-丙内酯溶液，使终浓度分别为0.2%、0.15%、0.1%、0.05%、0.025%，4 ℃ 130 r/min 灭活，32 h 内每隔8 h 取样，37 ℃作用2 h 终止。

2.1.3 N-乙酰乙烯亚胺灭活最佳条件：在病毒液中缓慢滴加稀释后的N-乙酰乙烯亚胺溶液，使终浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，37 ℃130 r/min 灭活，32 h 内每隔8 h 取样，加入等量10%硫代硫酸钠终止。

2.1.4 二乙烯亚胺灭活最佳条件：在病毒液中缓慢滴加稀释后二乙烯亚胺溶液，使终浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，37 ℃ 130 r/min 灭活，32 h 内每隔8 h 取样，加等量10%硫代硫酸钠终止。

2.1.5 盐酸聚六亚甲基胍灭活最佳条件：在病毒液中缓慢滴加盐酸聚六亚甲基胍溶液，使终浓度分别为1%、2%、3%、4%和5%，37 ℃ 130 r/min 灭活，32 h 内每隔8 h 取样。

2.2 无菌检验

取灭活病毒液，进行无菌检验。

2.3 HA 效价

取灭活病毒液，进行HA 效价测定。

2.4 灭活检验

将灭活病毒液通过尿囊腔接种10 枚10 日龄SPF 鸡胚，每枚0.1 mL。36 ℃孵育72 h，2 ～8 ℃冷却，并盲传1 代，测定HA 效价，若均为阴性，则灭活完全，反之亦然。

2.5 效力检验

取30 只3 周龄SPF 鸡，每只胸部肌肉或颈部皮下接种疫苗0.3 mL，同时设对照鸡15 只。接种21 日后采血，分离血清，用禽流感病毒H5 亚型H5-Re13 株、H5-Re14 株和H7 亚型H7-Re4 株血凝抑制试验抗原测定HI 抗体效价。

2.6 安全性检验

取10 只3 周龄的SPF 鸡，各胸部肌肉或颈部皮下接种疫苗2.0 mL，每日观察，连续14 d，观察是否有疫苗引起的不良反应。

3 结果

3.1 病毒的灭活

3.1.1 甲醛最佳灭活条件的确定：依据最佳灭活条件的判断标准，确定甲醛灭活的最佳条件为37 ℃0.025%浓度灭活24 h。

3.1.2 β-丙内酯最佳灭活条件的确定：依据最佳灭活条件的判断标准，确定β-丙内酯灭活的最佳条件为4 ℃ 0.05%浓度灭活24 h。

3.1.3 N-乙酰乙烯亚胺最佳灭活条件的确定：依据最佳灭活条件的判断标准，确定N-乙酰乙烯亚胺灭活的最佳条件为37 ℃ 0.5%浓度灭活24 h。

3.1.4 二乙烯亚胺最佳灭活条件的确定：依据最佳灭活条件的判断标准，确定二乙烯亚胺灭活的最佳条件为37℃ 0.5%浓度灭活24 h。

3.1.5 盐酸聚六亚甲基胍最佳灭活条件的确定：依据最佳灭活条件的判断标准，确定盐酸聚六亚甲基胍灭活的最佳条件为37 ℃ 1%浓度灭活24 h。

3.2 效力检验

甲醛灭活疫苗组、β-丙内酯灭活疫苗组和二乙烯亚胺组灭活疫苗组免疫21 d 后H5-Re13株、H5-Re14 株和H7-Re4 株抗体效价（GMT）均在8log2 以上。N-乙酰乙烯亚胺灭活疫苗组和盐酸聚六亚甲基胍灭活疫苗组免疫21 d 后H5-Re13株、H5-Re14 株和H7-Re4 株抗体效价（GMT）均在7log2 以上。结果表明，抗体效价甲醛灭活疫苗组、β-丙内酯灭活疫苗组、二乙烯亚胺灭活疫苗组抗体效价高于N-乙酰乙烯亚胺灭活疫苗组、盐酸聚六亚甲基胍灭活疫苗组。

3.3 安全性检验

结果表明，β-丙内酯、甲醛、二乙烯亚胺、N-乙酰乙烯亚胺、盐酸聚六亚甲基灭活疫苗免疫鸡后，连续观察14 d，免疫部位均无炎症反应，疫苗均吸收良好，采食、饮水和精神状态均正常，无不良临床症状。

4 讨论

多年来,通常都是用甲醛作为动物用灭活疫苗灭活剂。但其存在强刺激性、强致癌、残留过多易产生应激反应等缺陷[3]。国内外学者一直在探寻更理想的灭活剂用于AIV 灭活疫苗的生产。施维松等［4］使用二乙烯亚胺对禽流感病毒Re-5 株进行灭活，并筛选出了灭活的最佳条件，制苗免疫后二乙烯亚胺灭活疫苗抗体效价高于甲醛灭活疫苗。黄文科等［5］使用β-丙内酯对禽流感病毒H9N2 进行了灭活，配苗后免疫抗体效价与甲醛相当。

疫苗生产中应根据病毒的种类，选择不同的灭活剂用于灭活，在选用灭活剂时以较低浓度、温度和较短作用时间处理为好，以保证疫苗安全与效价。以此为依据，本研究设计了不同浓度的β-丙内酯、甲醛、二乙烯亚胺、N-乙酰乙烯亚胺、盐酸聚六亚甲基胍作为灭活剂，在不同作用时间下对AIV 进行的灭活，通过血凝（HA）试验、灭活和无菌检验确定了β-丙内酯、甲醛、二乙烯亚胺、N-乙酰乙烯亚胺、盐酸聚六亚甲基最佳的灭活条件。将灭活后的病毒液配苗，进行安全性检验，结果表明接种SPF 鸡后均无不良反应。效力检验结果表明，甲醛、β-丙内酯、二乙烯亚胺抗体效价均在8log2以上，N-乙酰乙烯亚胺和盐酸聚六亚甲基体效价均在7log2 以上，均远高于国家标准（6log2）。从5 种灭活剂对AIV 灭活,通过HA 试验、无菌检验、灭活检验结果以及对SPF 鸡的抗体效价综合分析，再从毒性及试剂稳定性来考虑，最好的灭活剂为β-丙内酯，其次为二乙烯亚胺和甲醛，最后为N-乙酰乙烯亚胺和盐酸聚六亚甲基,本研究为禽流感病毒的灭活提供参考依据，为规模化生产重组禽流感病毒细胞源灭活疫苗所需的理想灭活剂应用提供了依据。考虑到β-丙内酯成本较高，不同的疫苗企业可根据自己的实际情况进行选择。