续筋接骨液对兔肩袖损伤修复模型腱骨界面PI3K/Akt信号通路的影响

危建文,曹寅生,金久楚,刘 雄,邹 冕

(1. 湖南中医药大学,湖南 长沙 410208;2. 湖南中医药大学第一附属医院,湖南 长沙 410007)

肩袖损伤是以肩痛、乏力伴肩关节活动障碍为主要表现的肩部疾病,多由劳损、外力等因素造成,常见于中老年人,严重影响患者生活质量[1-2]。肩袖损伤多采用保守治疗,保守治疗失败后需进行手术,以达到改善肩部功能并缓解疼痛的目的。关节镜下肩袖修补术是目前治疗肩袖损伤最主流的手术方式[3],但是术后腱骨结合部是否完整愈合严重影响治疗效果。相关研究显示,肩袖修补术后再撕裂率可达到20%～30%[4],其原因与腱骨界面结构以及炎症反应有着直接关系[5]。前期研究表明,续筋接骨液能增加肩袖修补术后腱骨组织抗拉强度[6],但其作用机制仍不明确。PI3K/Akt信号通路参与调控细胞增殖、分化等生命活动[7],基于此,本课题组研究了续筋接骨液对兔肩袖损伤修复术后腱骨组织中PI3K/Akt信号通路的影响,以探讨其促进腱骨愈合的作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康雄性新西兰大白兔15只,清洁级,体重2.0～2.5 kg,购于湖南中医药大学动物实验中心并饲养于该中心,动物许可证号:SCXK(湘)2020-0005,单位许可证号:SYXK(湘)2022-0003。所有兔常规饲养,实验室室温21～26 ℃,相对湿度50%～55%,环境干净整洁、安静,单笼饲养,自由摄水,保持12 h昼夜轮替。本实验经湖南中医药大学伦理委员会批准(ZYFY20220513-01)。

1.2主要药物及试剂 续筋接骨液(湖南中医药大学第一附属医院院内制剂,批号:20220925,规格:250 mL/瓶);兔p-PI3K抗体(北京博奥森,批号:bs-5570r);兔p-Akt抗体(美国CST,批号:#4060);兔GAPDH抗体(美国proteintech,批号:10494-1-AP);miRNA反转录试剂盒(北京康为世纪,批号:CW2141)。

1.3主要仪器 摇床、旋涡混合器(中国江苏其林贝尔,型号分别为TS-1和GL-88B);台式冷冻离心机(中国湖南湘仪,型号:H1650R);荧光定量RCP仪、荧光PCR板(美国Thermo公司,型号分别为PIKOREAL96和SPL0960);电泳仪、水平琼脂糖电泳槽(中国北京六一有限公司,型号分别为DYY-2C和DYCP-31DN);-80 ℃冰箱(中国美菱有限公司,型号:DW-HW438)。化学发光成像系统(中国勤翔,型号:ChemiScope6100);生物样品均质仪(中国杭州奥盛,型号:BioPrep-24)。

1.4实验方法 随机取5只兔作为空白组,其余兔参考寇景浩等[8]方法建立肩袖损伤修复模型:戊巴比妥钠腹腔注射麻醉兔后,固定于无菌手术台,左肩做纵向2 cm切口,逐层分离,暴露冈上肌,缝线标记,在大结节止点处锐性切断冈上肌肌腱,用克氏针在肱骨大结节制作孔道,丝线通过孔道将切断的冈上肌肌腱缝合固定大结节止点处,逐层关闭切口。术后肌注青霉素20万IU,持续3 d。将造模兔随机分为模型组、续筋接骨组各5只。续筋接骨组给予续筋接骨液56 mg/kg灌胃(参照剂量-体表面积换算方法[9]计算给药量,药物和蒸馏水配置成混悬液,灌胃量为10 mL/kg),空白组、模型组给予等量生理盐水灌胃,均2次/d,连续灌胃8周。

1.5检测指标及方法

1.5.1腱骨组织HE染色病理形态 末次灌胃结束后,采用空气栓塞法处死兔,在无菌环境下暴露兔造模侧肩关节,取部分下冈上肌及连接的上段肱骨(腱骨组织),予烤片、切片、脱蜡、脱水、苏木素染色、伊红染色、梯度酒精脱水、透明封片等处理,采用普通光学显微镜观察腱骨组织形态。

1.5.2腱骨组织中p-PI3K、p-Akt蛋白表达情况采用Western blot法检测:取-80 ℃冻存的腱骨组织,剪碎,经RIPA裂解液裂解后,4 ℃下12 000 r/min离心15 min,收集上清液。SDS-PAGE分离蛋白,转膜,PBST清洗。脱脂奶粉液封闭,室温静置90 min,4 ℃过夜,次日室温静置30 min。加入p-PI3K、p-Akt一抗(稀释度均为1∶2 000),4 ℃孵育过夜,再洗膜3次×15 min。加二抗(稀释度1∶5 000),室温孵育90 min,洗膜3次×10 min。将膜置入ECL化学发光液孵育1 min,再用滤纸吸干,凝胶成像系统成像,用Quantity One 4.6.2软件进行分析,以GAPDH为内参计算蛋白相对表达量。

1.5.3腱骨组织中PI3K、Akt mRNA表达情况 采用RT-qPCR法检测:取冻存的腱骨组织,经Trizol裂解,提取总的RNA。反转录为cDNA,行PCR反应。PCR反应体系:cDNA模板2 μL,PrimerR(10 μmol)1 μL,PrimerF(10 μmol)1 μL,ddH2O 11 μL,2X SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性10 min;95 ℃变性15 s,60 ℃退火30 s,循环40次。反应结束后采用2-ΔΔCT法计算各基因相对表达量。兔引物序列见表1。

表1 兔引物序列

2 结 果

2.1各组兔腱骨组织HE染色病理形态 空白组兔肌腱-骨连接紧密,肌腱与骨组织之间界限清晰,胶原纤维排列整齐;模型组兔肌腱-骨连接不完全,胶原纤维排列紊乱;续筋接骨组兔肌腱-骨紧密连接,腱骨界面有大量致密结缔组,并且有新生血管。见图1。

2.2各组兔腱骨组织中p-PI3K、p-Akt蛋白表达情况比较 模型组造模侧腱骨组织中p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05),续筋接骨组造模侧腱骨组织中p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)。见图2及表2。

图1 空白组和肩袖损伤修复术后各组兔腱骨界面组织HE染色表现(×400)

图2 空白组和肩袖损伤修复术后各组兔腱骨组织中p-PI3K、p-Akt蛋白表达电泳图

2.3各组兔腱骨组织中PI3K、Akt mRNA表达情况比较 模型组造模侧腱骨组织中PI3K、Akt mRNA相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05),续筋接骨组造模侧腱骨组织中PI3K、Akt mRNA相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)。见表3。

3 讨 论

表2 空白组和肩袖损伤修复术后各组兔腱骨组织中p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量比较

表3 空白组和肩袖损伤修复术后各组兔腱骨组织中PI3K、Akt mRNA相对表达量比较

肩袖通过肌腱附着于肱骨,其特殊的腱骨界面结构能将应力载荷从肌腱转移至骨骼而完成力的传导,减少肌腱劳损[10]。肩袖修复术后促进腱骨界面愈合是保证手术效果的重要因素,也是运动医学的研究热点。正常腱骨界面由肌腱、未钙化的纤维软骨、钙化纤维软骨和骨组成[11],结合腱骨界面特殊结构,促进其中的软骨、骨及肌腱的形成,可直接加速腱骨愈合[12]。

PI3K/Akt信号通路是调节细胞生命活动的重要通路,PI3K可以被上游细胞因子如转化生长因子-β(TGF-β)、骨形态发生蛋白(BMPs)等激活为p-PI3K[13]。p-PI3K可作为第二信使募集Akt,使其被激活为p-Akt,再将信号传递至下游效应蛋白[14]。近年来研究发现,PI3K/Akt信号通路可以参与调控成骨间充质干细胞(BMSCs)成骨分化迁移[15]和BMSCs肌腱诱导分化[16],可以上调血管内皮生长因子(VEGF)水平,增加血管数量[17]。而充足的血运可为腱骨界面修复提供营养,同时也能传输炎症代谢产物。过度的炎症应激导致组织水肿并瘢痕化,影响腱骨结构中软骨层的长入,破坏其生物力学机制[18],而PI3K/Akt信号通路可参与调控TNF-α、IL-6表达水平[19]。

中医药目前广泛应用于骨折筋伤疾病。续筋接骨液为湖南中医药大学第一附属医院经验制剂,由丹参、续断、骨碎补、杜仲、自然铜等药组成,全方共奏活血养血、补益肝肾、接骨续筋之效。药理学研究表明,丹参酮ⅡA[20]、续断皂苷Ⅵ[21]能促进BMSCs增殖并向成骨细胞分化;骨碎补不仅能促进BMSCs成骨分化,还能抑制破骨细胞活性,抑制氧化应激反应[22];杜仲叶提取物可促进局部毛细血管再生,改善微循环[23]。前期临床研究证实,续筋接骨液内服能有效缓解肩袖损伤患者疼痛,改善肩关节活动[24]。

本实验结果显示,模型组腱骨界面连接不完全,胶原纤维排列紊乱,腱骨组织中p-PI3K、p-Akt蛋白及PI3K、Akt mRNA表达量均明显升高,说明肩袖损伤术后PI3K/Akt通路明显活化;与模型组比较,续筋接骨组腱骨界面大量结缔组织,连接紧密,胶原纤维排列有序,腱骨组织中p-PI3K、p-Akt蛋白及PI3K、Akt mRNA表达量均明显降低,说明续筋接骨液可以抑制PI3K/Akt通路的活化。

综上,续筋接骨液可能通过抑制PI3K/Akt信号通路活化而促进兔肩袖损伤修复术后腱骨愈合。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。