无籽刺梨果实生长发育的解剖结构观察

杜 倩,李昌颖,宋贞富,钟思玲,周 奎,文晓鹏

(1 贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室,贵阳,550025;2 安顺市农业科学院,贵州安顺,562100)

无籽刺梨(RosasterilisS.D. Shi)别名搭钩刺梨、光枝无籽刺梨和安顺金刺梨等,是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)植物,在贵州喀斯特地区瘠薄的土壤条件下能很好地生长,是贵州喀斯特地区植被恢复的重要树种[1-2]。果实含有丰富的维生素C,皮刺较少且稀疏,果实成熟时呈橙黄色[3],由于无籽刺梨的果实没有种子,偶尔个别果实中含有1～2粒饱满种子,通常会受到生产者和消费者的喜爱。无籽刺梨主要分布于我国西南地区,在贵州安顺、兴仁等地居多[4]。已有一些学者对无籽刺梨果实品质开展过研究,发现无籽刺梨果实品质与种植地区土壤条件有密切关系,为喀斯特地区无籽刺梨生产和无籽刺梨品质生态区划提供了依据[5]。目前为止,关于无籽刺梨果实加工及栽培方面的研究有许多报道[6-7],但对无籽刺梨果实解剖结构方面的研究较少,且主要集中在果实表皮毛形态结构[8]。本试验通过对无籽刺梨果实生长发育过程中的形态及组织解剖进行系统研究,明确无籽刺梨不同发育时期的解剖结构的变化特征,以期为无籽刺梨果实发育的细胞学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料2021年4月至2021年10月,在贵州省安顺市普定县农科所(26°30′68″ N,105°84′24″ E,海拔1 368.2 m)观察和收获无籽刺梨花蕾、花和果实。试验材料为10年生无籽刺梨,从显蕾开始观察直到果实成熟。待花谢后,每间隔15 d采集一次果实。采集的花蕾、花和果实一部分带回实验室用于形态特征观察;另一部分立刻置于FAA固定液(V无水乙醇∶V冰乙酸∶V甲醛=18∶1∶1)中固定24 h后,取出冲洗2～3次,之后转入70%乙醇中,于4 ℃冰箱长期保存。

1.2 果实形态学观察选取5株无籽刺梨树,每隔一定时期进行采样观测,每次每株树在树冠外围东、西、南、北、中5个方位各摘取2个果实。使用电子游标卡尺(MNT-150T,美耐特)测量果实纵径和横径。使用电子天平(JJ200,双杰)测定果实鲜质量。

1.3 果实石蜡切片制作取材、固定:取新鲜果实于70% FAA中固定24 h以上,用真空气筒抽气,使果实沉底。

脱水、透明、浸蜡:将材料放入脱水机(YD-12P,益迪)中进行梯度脱水、透明、浸蜡,具体步骤为70%酒精2 h→85%酒精2 h→95%酒精2 h→95%酒精2 h→无水乙醇50 min→无水乙醇40 min→无水乙醇+二甲苯2 h→二甲苯1 h→二甲苯1 h→蜡4 h→蜡3 h→蜡3 h。

包埋:将材料从脱水机中取出来,在包埋机(YD-6L,益迪)内进行包埋,包埋好的组织块放在冷冻台(YD,益迪)上进行凝固。

切片、烤片:修整蜡块、调整好切片机(YD-315,益迪)后进行切片,切片厚度8 μm。用毛笔把切好的蜡片轻放在42 ℃的水槽中,用载玻片中央位置去捞取展开后的蜡片,放在烤片机(YD-AB2,益迪)上进行烤片。

脱蜡、染色、脱水:将材料放入染色机(YD-700,益迪)中进行脱蜡、染色脱水,具体步骤为二甲苯30 min →二甲苯30 min →二甲苯+无水乙醇3 min →无水乙醇3 min →无水乙醇3 min →95%酒精3 min → 85%酒精3 min →70%酒精3 min →50%酒精3 min →1%番红12 h →清水30 s →50%酒精15 s →70%酒精5 min →85%酒精5 min →95%酒精5 min →1%固绿15 s → 95%酒精5 min →无水乙醇5 min →无水乙醇5 min →二甲苯5 min →二甲苯5 min。

封片、镜检:滴1～2滴中性树胶于载玻片的样品上,将洁净的盖玻片倾斜放下,封片,置于显微镜(ECLIPSE SI)下观察。

1.4 指标测定用ECLIPSE SI显微镜拍照后,十字交叉法测量细胞纵横径。

1.5 数据分析使用Graphpad prim 9软件进行试验数据统计并作图。

2 结果与分析

2.1 果实形态变化无籽刺梨一般4月初开始现蕾,花为完全花,多朵花聚集组成不规则的伞房花序或复伞房花序。花的发育始于花冠管的伸长和花蕾的膨胀(见图1A)。花蕾持续时间较长,1个月左右花蕾开始含苞欲放(见图1B),1～2 d后出现5个粉白色花瓣平展的花朵(见图1C),花期长达1个月左右,暴露的雄蕊变成褐色并枯萎(见图1D),随后出现小果(见图1E)。

注:(A)花蕾;(B)含苞欲放的花;(C)完全开放的花;(D)凋落后的萎缩雄蕊;(E)花后小果。图1 无籽刺梨从花蕾至小果各发育阶段的状况

果实是假果,是由瓶状花托和子房共同发育而来。花后2周(2 Weeks After Anthesis,2 WAA)至花后5周的果实形状为卵球形,颜色为青绿色,果实上布满小刺(见图2A和图2B);花后11周的果实为淡黄绿色(见图2C);花后18周的果实形状为卵球形且已经趋于成熟,大部分小刺已经脱落,果实颜色为橙黄色(见图2D)。无籽刺梨败育种子为干瘪状(见图2A-D)。无籽刺梨的果实从开花到完全成熟大约需要23周(161 d)。

注:A为2 WAA的果实;B为5 WAA的果实;C为11 WAA的果实;D为18 WAA的果实。图2 无籽刺梨不同发育时期的果实

2.2 果实生长模式无籽刺梨果实纵径、横径和鲜质量随着果实的生长发育而增加。根据变化趋势将其分为4个阶段,即阶段1(S1)、阶段2(S2)、阶段3(S3)和阶段4(S4)(见图3)。在无籽刺梨果实生长发育过程中,纵横径变化趋势基本一致,纵径始终大于横径。果实迅速生长时期为花后2周至花后4周(即S1阶段)和花后8周至花后14周(即S3阶段),果实生长缓慢时期为花后4周至花后8周(即S2阶段)和花后14周至花后18周(即S4阶段)。果实横径从S1阶段的11.12 mm增加到S4阶段的25.54 mm,纵径从S1阶段的14.03 mm增加到S4阶段的26.91 mm(见图3),质量从S1阶段的0.72 g增加到S4阶段的5.20 g(见图3)。无籽刺梨的单果果实发育总体呈现“快-慢-快-慢”的变化趋势,呈现双S型生长模式。

图3 无籽刺梨果实纵横径和质量增长曲线

2.3 果实解剖结构变化从横切面来看,无籽刺梨果实的果皮已特化为3个细胞层,即外果皮、中果皮和内果皮。外果皮是由子房外壁细胞发育而来,S1阶段外果皮由6～7层细胞组成;表皮由1层细胞组成,细胞呈长矩形、较小且排列紧密,是果实表面的覆盖层(见图4A);幼果外表皮基部有多细胞组成的表皮毛,未观察到角质膜(见图4B)。中果皮由薄壁细胞和分布其中的维管束组成,中果皮细胞比邻近的外果皮和内果皮细胞大,中果皮细胞呈长圆形,细胞排列紧密,大小不规则,含有丰富的维管组织,且部分薄壁细胞含有内含物淀粉。内果皮由2～3层细胞组成,最内层表皮细胞由1层细胞组成,细胞呈长矩形,且排列紧密,比邻近果肉细胞小(见图4C)。

注:EX:外果皮,SG:淀粉粒,EH:表皮毛,EN:内果皮,ME:中果皮。图5至图6同。图4 S1阶段果实的横切面

与S1阶段的细胞相比,S2阶段的细胞随着果实的生长和发育,经历了分裂和膨大,因此,S2阶段的细胞比S1阶段大。S2阶段,表皮细胞由2层长圆形细胞组成,排列紧密且细胞较大,表皮外是由蜡质和角质组成的薄薄角质膜(见图5A);中果皮细胞大小不规则,呈长圆形(见图5C),此阶段,果实的外果皮区域和内果皮区域与中果皮区域可以明显区分,中果皮区域的细胞比内、外果皮区域的细胞要大,细胞中存在内含物淀粉;内果皮由2～3层细胞组成,最内层表皮细胞形状为大小一致的长方形且排列紧密(图5C)。

注:c:角质层,红色箭头表示分裂细胞。图5 S2阶段果实的横切面

与S2阶段的细胞相比,S3阶段的细胞进一步膨大,细胞体积增大,且细胞的纵径显著大于横径。S3阶段,表皮由4～5层长圆形细胞组成,排列紧密且细胞较大,表皮外有一层厚厚的角质膜(见图6A),表皮细胞层数基本不再变化,外果皮壁加厚;中果皮细胞大小不规则,呈长形,细胞间有空隙,观察到螺纹导管(见图6B),淀粉粒逐渐变少,直至淀粉消失;内果皮由3～4层细胞组成,最内层表皮细胞形状为大小一致的长方形,且排列紧密(见图6C)。

注:SV:螺纹导管。图6 S3阶段果实的横切面

与S3阶段的细胞相比,S4阶段的细胞停止了膨大。S4阶段,表皮细胞由4～5层不规则细胞组成,排列紧密且细胞较大,表皮细胞外层有一层厚厚的角质膜(见图7A),随着果实的成熟,表皮毛脱落;中果皮中的薄壁细胞不规则且松散堆积,细胞间的间隙变大,观察到螺纹导管(见图7B);内果皮由3～4层细胞组成,最内层表皮细胞形状为大小不一致的长方形,且排列紧密(见图7C)。果肉完全发育成熟时,细胞中的淀粉粒完全消失。

注:EX:外果皮,EN:内果皮,ME:中果皮,SV:螺纹导管,比例尺是50 μm。图7 S4阶段果实的横切面

不同发育阶段果皮组织层细胞大小(纵径和横径)差异的情况见图8。总体趋势为随果实发育,各果皮组织层细胞均呈增大。

注:S1:2 WAA;S2:5 WAA;S3:11 WAA;S4:16 WAA。图8 无籽刺梨果实细胞纵横径

2.4 石细胞和维管束变化维管束主要分布在中果皮中,根据维管束在中果皮的分布位置与结构不同,有两种维管束,即分散维管束和外周维管束,分散维管束分布于中果皮中,而外周维管束环绕于中果皮外侧区域。

在S1阶段,果实嫩绿色,在初生韧皮部及初生木质部之间存在束中维管束,具有一定的分生能力,形成次生组织,增大它们在中果皮中的空间,此时期果皮中的分散维管束木质部导管或管胞木质化程度较低,韧皮部比较发达,分散维管束截面近扇形(见图9A),外周维管束绕中果皮外侧排列成一圈(见图9B)。在S2阶段,木质部导管排列规则,且导管壁清晰,中果皮中的分散维管束的横截面积增加,木质部导管明显增加,此时期的维管束截面近扇形(图9C),外周维管束中薄壁细胞部分细胞的细胞壁均匀加厚,形成厚壁细胞,细胞壁继续加厚特化为石细胞,石细胞原基细胞出现在该时期(见图9D)。在S3阶段,随着细胞快速生长,木质部薄壁细胞膨大,此时期维管束的横截面积最大(见图10),木质部导管清晰可见,木质素沉积速度明显加快(见图9E),石细胞团次生壁木质化明显加厚,石细胞团达到高峰(见图9F)。在S4阶段,随着果实成熟,中果皮中的维管束的可见度降低,大部分维管束木质化,维管束横截面积最小(见图10),维管束截面近圆形(见图9G),石细胞高度木质化且含量降低。

图10 无籽刺梨中果皮维管束纵横径

中果皮维管束大小(纵横径)表现为随发育先增后降,以S3阶段最大(见图10)。

2.5 种子形态和解剖结构

无籽刺梨果实在10月份左右成熟,少数果实有1～2粒种子。种子的形成是由胚珠经过传粉受精形成,而无籽刺梨花粉败育,导致胚珠受精失败,形成败育种子。无籽刺梨败育种子的解剖结构变化由花后3周、花后5周及花后17周采集的败育种子表示。利用体视镜显微镜和石蜡切片对不同发育时期的种子进行形态结构和解剖观察发现,花后3周的败育种子呈细长形,灰绿色,外种皮由两层细胞垂直于内种皮细胞组成,内种皮由零散细胞组成,外种皮细胞木质化,种皮发育完整,种皮内部可以清晰地观察到子叶,未观察到胚乳和胚,胚柄系统断裂,导致种皮内部系统无法吸收养分(见图11A、D):花后5周的败育种子呈细长形,黑绿色,解剖观察到种皮发育完整,内种皮细胞部分木质化,种皮内部系统皱缩且胚柄系统断裂(见图11B和E);花后17周的败育种子呈细长形,黑色,解剖观察到种皮发育完整,内、外种皮细胞木质化程度加强,种皮内部系统皱缩且胚柄系统断裂(见图11C和F)。

注:(A、D)3 WAA种子;(B、E)5 WAA种子;(C、F)17 WAA种子;Ext:内种皮,Ent:外种皮,Cy:子叶,Su:胚柄。图11 无籽刺梨种子的形态和解剖结构

3 讨论

3.1 无籽刺梨果实生长发育的细胞学特征

无籽刺梨在贵州省主要分布于安顺、兴仁等地,从开花到果实成熟约需要161 d,是贵州省特有品种,这可能归因于贵州的气候、光照强度、降雨量和湿度等生长环境。无籽刺梨果实生长发育呈双S型生长曲线,其中横径、纵径、鲜质量随着果实生长发育主要分为4个阶段,即S1快速生长阶段、S2缓慢生长阶段、S3快速生长阶段和S4缓慢生长阶段。在桃[9]、草莓[10]和灵武长枣[11]中也发现了类似的生长模式,在快速生长阶段加强肥水管理有助于果实膨大,提高果实品质。

无籽刺梨果实形态特征与细胞结构的变化一致。无籽刺梨的子房壁直接发育的果皮已特化为3个细胞层,即外果皮、中果皮和内果皮,在刺黄果[12]和杧果[13]中也发现了果实的外果皮、中果皮和内果皮,即特化的果皮组织。在S1阶段,果实细胞排列紧密,无细胞间隙,果实的外果皮和内果皮细胞小于中果皮细胞;在外果皮最外层生长有不同大小的表皮毛,可以防止水分的散失和病毒的侵染;中果皮内含有丰富的维管束,运输水分、无机盐和有机养料等,此阶段的维管束呈扇形,在薄壁细胞中积累了部分的淀粉粒。一般认为果实大小是果实细胞数量和大小共同决定,细胞数量是基础,细胞大小是关键[14]。在S2阶段,果实细胞进一步分裂和膨大,细胞间隙极小,维管束发育良好,在表皮细胞外有一层薄薄的角质膜,角质膜也是抵抗病菌和害虫咬食的保护层[15];外周维管束中的薄壁细胞特化为石细胞,据在香梨中的报道[16],维管束与石细胞存在一定的连接,维管束的营养物质运输或者生理代谢引起果实石细胞的变化;此阶段的薄壁细胞中积累大量的淀粉粒,果实质量从0.72 g增加到1.64 g,细胞生长缓慢。在S3阶段,果实细胞进一步膨大,石细胞在果皮两端多、中间少,在果皮中的内含物淀粉逐渐减少,细胞快速生长。在S4阶段,果实细胞停止了膨大,细胞间的间隙变大,在分散维管束中,维管束可见度降低。在猕猴桃中[17]由于快速生长过程中拉伸的细胞导致了木质部血管破坏,因此,木质部血管的破坏可能是导致无籽刺梨果实中维管束可见度降低。果实淀粉含量呈现S1/S2阶段升高、S3/S4阶段下降的变化趋势。果肉的淀粉粒完全消失,这可能是淀粉粒逐渐被水解的缘故[18]。在S4阶段,石细胞团密度和体积大小基本稳定。在梨果实中[19]研究得出,果肉中石细胞团密度和大小是决定果实口感的主要因素,因此可以通过控制石细胞的含量和大小来改善无籽刺梨果实的口感。在S4阶段中细胞结构的变化表明S4果实处于成熟阶段。

3.2 无籽刺梨种子败育的细胞学特征

雄性不育,如花药退化、花粉败育和绒毡层发育不正常,都会导致种子败育[20]。无籽刺梨花粉败育[21],导致授粉失败,败育种子外形呈干瘪状且随着果实的生长发育颜色变黑,未授粉的胚珠发育中止,种子败育。理论上,种子由种皮、胚和胚乳三部分结构组成。解剖观察发现,无籽刺梨的种皮发育完整,但种皮以内的内部系统皱缩且胚柄系统断裂,导致种子败育。在百山祖冷杉种子中也发现了未授粉的胚珠几乎全部发育中止,导致发育异常种子的数量剧增[22]。除此之外,雌蕊原基形成后至雌配子体形成的任何时期均可能发生雌蕊败育[23],从而导致种子败育。本试验中,无籽刺梨种子败育的细胞学特征仅以花后15 d后不同发育时期的种子解剖结构作为败育依据,今后应继续观察无籽刺梨胚珠中的孢原细胞、胚囊原始细胞以及不同发育程度的胚囊,完善无籽刺梨种子败育的原因。

4 结论

无籽刺梨果实从开花到成熟约需要161 d。果实生长发育为双S型生长曲线,包括4个明显的阶段,即S1快速生长阶段、S2缓慢生长阶段、S3快速生长阶段和S4缓慢生长阶段。在细胞水平上,揭示了无籽刺梨发生细胞分裂和细胞膨大以增加细胞数量和果实大小。通过形态和解剖结构观察揭示了无籽刺梨果实的生长模式及解剖学结构特征,可为果实的生长发育调控研究提供参考,同时,可为科学制定无籽刺梨栽培管理措施提供依据。