龙安柚果皮果胶超声波辅助复合酶法提取工艺优化

赵 静,谭 玉,房可欣,吴 霜,柳 廷,王庆彪

(广安职业技术学院,四川广安,638000)

龙安柚(Citrusgrandis‘Longanyou’)产于四川省广安市,果肉粉红,肉质脆嫩,酸甜适中,汁多,少核或无核,于2008年获准成为国家地理标志保护产品[1]。近年来,龙安柚作为当地的优势特色农产品得到了大力发展,正逐步成为新的农业支柱产业之一[2]。在龙安柚的销售与加工过程中,柚皮多被废弃。果胶是一种存在于水果、蔬菜等植物壁中特有的直线型高分子多糖聚合物,因具有良好的胶凝性、乳化稳定性和生理功效,而被广泛应用于食品、医药、烟草以及纺织行业[3]。柚皮富含果胶,利用龙安柚的果皮提取果胶,可以减少柚皮资源浪费,提升柚果附加值,有利于提高龙安柚产业的稳定性。果胶大多数存在于植物细胞壁中,原果胶难溶于水,并且植物硬度与原果胶含量有关[4],经过酸、碱、盐、酶或超声波等外界因素的作用,再经过分离工艺,可提取出细胞壁中的水溶性果胶。果胶提取法主要有超声提取法、微波提取法、酸提取法、萃取法、离子交换法和酶提取法等,不同的提取方法各有优劣,目前生产中常用的植物果胶提取方法是将多种方法结合的复合提取法[5]。已有研究者对酶法协同超声波辅助酸法提取马家柚果皮果胶的工艺进行了探索[6]。针对龙安柚的研究报道已经涵盖育种栽培、保鲜、果皮加工和天然产物提取等方面[7-11],但尚未见龙安柚柚皮果胶提取工艺的研究报道。本研究采用超声波辅助复合酶法提取龙安柚柚皮果胶,在单因素试验基础上,利用Plackett-Burman设计筛选影响龙安柚柚皮果胶得率的主要因素,再采用Box-Behnken设计优化果胶提取工艺,为后续进一步分析龙安柚柚皮果胶理化特性、功能性和深加工提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

龙安柚果实为广安本地市售。纤维素酶(2×104U/g)、木瓜蛋白酶(8×105U/g)和无水柠檬酸(均为食品级),由北京索莱宝科技有限公司生产。无水乙醇,重庆川东化工有限公司生产。

1.2 仪器和设备

超声清洗机(KH5200DE,昆山禾创超声仪器有限公司),恒温水浴锅(常州智博瑞仪器制造有限公司),pH计(PHS-3C ,上海仪电科学仪器股份有限公司),数显恒温鼓风干燥箱 (上海博迅实业有限公司),台式离心机(TGL-16,上海卢湘仪离心机仪器有限公司),粉碎机(艾泽拉电器有限公司)等。

1.3 试验方法

1.3.1 柚皮预处理 新鲜龙安柚果实洗净后,取果皮切成1 cm ×1 cm颗粒,于沸腾蒸馏水中漂烫5 min,置于50 ℃干燥箱中烘干,磨碎,过60目筛,将制备好的柚皮粉放于干燥器中密封备用。

1.3.2 柚皮果胶提取工艺 称取适量柚皮粉于锥形瓶中,根据不同料液比加入蒸馏水,加入一定比例的两种酶,水浴酶解前加入无水柠檬酸调节提取液至不同pH值,于不同温度下水浴酶解一定时间,设置一定超声功率、时间和温度在超声波清洗机中提取果胶,完成提取后于离心机中离心10 min(4 000 转/min),取上清液。加入2倍体积的无水乙醇于上清液中,搅拌后静置30 min,离心15 min(6 000转/min ),弃上清液,保留沉淀,置于35 ℃烘箱中干燥至恒重,得到果胶。

1.3.3 工艺优化试验 单因素试验:分别对料液比(1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55 g/mL)、复合酶比例(预设酶添加总量为柚皮粉质量的2%[6],纤维素酶∶木瓜蛋白酶=1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5,质量比)、提取液pH值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、酶解温度(30、40、50、60、70 ℃)、酶解时间(30、40、50、60、70 min)、超声功率(40、50、60、70、80 W)、超声提取时间(15、20、25、30、35 min)和超声提取温度(40、50、60、70、80 ℃)进行单因素试验。不是试验因素时,各因素的设定值如下:料液比为1∶40,提取液pH值5.0,复合酶比例(纤维素酶∶木瓜蛋白酶)为1∶3,酶解温度50 ℃,酶解时间60 min,超声功率70 W,超声提取温度50 ℃,超声提取时间30 min。单因素试验每处理组称取5 g柚皮粉,并进行3次重复试验。

Plackett-Burman设计试验:在单因素试验基础上,以果胶得率作为响应值,对料液比、提取液pH值、复合酶比例、酶解温度、酶解时间、超声提取时间、超声功率、超声提取温度8个影响因素进行评价,试验因素和水平见表1。

表1 龙安柚柚皮果胶超声波辅助复合酶法提取工艺Plackett-Burman设计(因素与水平编码)

Box-Behnken设计试验:根据Plackett-Burman试验结果,选取提取液pH值、酶解时间、超声功率和超声提取温度4个因素作为自变量,以柚皮果胶得率为响应值,进行响应面优化试验,探索最佳工艺条件,并开展验证试验。Box-Behnken设计见表2。

表2 龙安柚柚皮果胶超声波辅助复合酶法提取工艺Box-Behnken设计(因素与水平编码)

1.3.4 果胶得率计算 果胶得率(%)=(提取的果胶质量/干燥柚皮粉质量)×100%。

1.4 数据分析

用Minitab19软件进行Plackett-Burman试验设计和数据分析;Design-Expert 8.05 软件进行Box-Behnken试验设计及数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

由图1A可知,果胶得率随着提取液(蒸馏水)比例的增大呈现先上升后下降的趋势,当料液比为1∶40时果胶得率最大。这可能是溶剂浸入植物细胞中,加快果胶水解溶出,当料液比继续增大时,提取液比例太大,溶液中果胶浓度下降,不利于溶出。

注:不是试验因素时的设定值,料液比为1∶40,提取液pH值5.0,复合酶比例(纤维素酶∶木瓜蛋白酶)为1∶3,酶解温度50 ℃,酶解时间60 min,超声功率70 W,超声提取温度50 ℃,超声提取时间30 min。图1 龙安柚柚皮果胶超声波辅助复合酶法提取各单因素对果胶得率的影响

由图1B可知,果胶得率随着pH值增加呈现先上升后下降的趋势,当pH值为5.0时果胶得率最大。这是因为复合酶在最适pH值范围内表现出最强活性,高于或低于这个范围,复合酶的活性降低。

由图1C可知,果胶得率随着酶解提取时间增加呈现先上升后下降趋势,当时间为30 min时果胶得率最大。这可能是由于提取时间较少时,果胶未完全水解,导致果胶得率较低,当提取时间超过长时,溶出的果胶在酸性环境下被分解或破坏,导致果胶得率下降[12]。

由图1D可知,随着酶解温度的升高,果胶得率先增加后减少,当酶解温度为50 ℃时,果胶得率最大,这可能是由于复合酶在最适温度范围内活性最大,当低于或高于这个范围,复合酶活性降低,因此最佳酶解温度选择50 ℃。

由图1E可知,果胶得率随着酶解时间的增加呈现先增加后减少趋势。这可能是因为酶解时间过长时,会导致果胶水解,反而降低果胶得率。

由图1F可知,果胶得率随着复合酶中木瓜蛋白酶比例的增大呈现先上升后趋于平稳趋势,当纤维素酶和木瓜蛋白酶比例为1∶3时果胶得率最大,这与周文俊等在提取柠檬果胶时所得结果一致[13],当木瓜蛋白酶用量较高时,部分酶会相互附着,导致果胶得率不再增加[14]。

由图1G可知,果胶得率随着超声功率的增大先上升后下降,超声功率为70 W时果胶得率最大。这可能是因为适宜的超声功率,其空化作用使柚皮细胞壁破裂,果胶溶出,当超声功率过高,超声波的空化作用过强,导致果胶水解过度,裂解成了多糖分子[15]。

由图1H可知,果胶得率随着超声提取温度的升高先上升后下降,温度50 ℃时果胶得率最大。这可能是因超声提取温度为50 ℃时酶促反应比较完全,随着温度继续上升,使复合酶活性降低。

2.2 Plackett-Burman试验

采用 Minitab 19软件对表3中的试验结果进行分析,各因素效应评价见表4。由表4可知,因素X2(提取液pH值)、X5(酶解时间)、X7(超声功率)和X8(超声提取温度)对果胶得率影响显著(p<0.05),且这4个因素对果胶得率影响排序为X8>X7>X5>X2;因素X1(料液比)、X3(超声提取时间)、X4(酶解温度)和X6(复合酶比例)对果胶得率影响不显著。因此,选择因素X2、X5、X7和X8进行后续响应面优化试验,综合考虑提取效率和成本,将因素X1、X3、X4和X6分别固定为1∶40、30 min、50 ℃和1∶3。

表3 龙安柚柚皮果胶超声波辅助复合酶法提取工艺Plackett-Burman试验设计及响应值

表4 龙安柚柚皮果胶超声波辅助复合酶法提取工艺Plackett-Burman试验设计各因素效应评价

2.3 响应面优化试验

2.3.1 响应面试验 Box-Behnken试验结果见表5。采用Design-Expert 8.0.5对表5中的试验结果进行多项拟合回归,得到果胶得率(Y)对提取液pH值(A)、酶解时间(B)、超声功率(C)以及超声提取温度(D)的二次多项回归方程:Y=27.33+0.40A-0.61B-0.62C+1.29D-0.57AB+0.50AC+0.033AD-0.0075BC-0.41BD-1.09CD-2.53A2-2.94B2-2.86C2-5.59D2。对回归模型进行方差分析,结果见表6。回归模型具有极显著性(p<0.000 1),失拟项不显著(p>0.05),说明该回归模型可靠,可用于龙安柚柚皮果胶得率的优化。该模型决定系数R2为0.988 7,表明该模型拟合度较好;校正决定系数为0.977 3,说明有约97.73%的果胶得率可以由该模型进行解释。一次项因素B、C、D,二次项因素A2、B2、C2、D2和交互项CD对果胶得率影响极显著(p<0.01),一次项因素A和交互项AB的影响为显著水平(p<0.05),交互项AC、AD、BC、BD则对果胶得率无显著影响。各一次项因素对果胶得率的影响程度为:D>C>B>A,与Plackett-Burman试验结果一致。超声提取温度(D)与超声功率(C)影响果胶得率的响应曲面见图2,果胶得率随着超声功率和超声提取温度的升高均出现先上升后下降的趋势,果胶得率存在极大值。

表5 龙安柚柚皮果胶超声波辅助复合酶法提取工艺Box-Behnken试验设计与结果

表6 龙安柚柚皮果胶超声波辅助复合酶法提取工艺回归模型方差分析结果

图2 超声功率与超声提取温度对果胶得率的影响

2.3.2 最佳提取工艺优化及验证 采用Design-Expert 8.0.5软件分析,确定提取柚皮果胶最佳工艺为提取液pH值5.04、酶解时间58.79 min、超声功率68.73 W、超声提取温度51.32 ℃。在此条件下,柚皮果胶得率最大理论值为27.51%。结合试验可操作性,优化最佳工艺为提取液pH值5.0、酶解时间59 min、超声功率70 W、超声提取温度51 ℃[其他条件:料液比1∶40、复合酶(纤维素酶∶木瓜蛋白酶)比例1∶3、酶解温度50 ℃、超声提取时间30 min。对优化最佳工艺进行3次平行验证试验,柚皮果胶得率平均值为27.43%,比最大理论值低0.08百分点,比刘媛洁等[6]采用单一纤维素酶(2×104U/g)酶协同超声波辅助酸法优化最佳工艺[酶用量1.7%、超声功率260 W、超声提取温度83 ℃、超声提取时间50 min、酶解时间70 min、料液比(g/mL)1∶25、提取液pH值2.0]提取马家柚柚皮果胶的平均得率(27.01%)高0.42百分点,并且酶解时间减少11 min。可见,本试验所得优化最佳工艺对于柚皮果胶的提取具有较高的实用价值。

3 结论

试验所得超声波辅助复合酶法提取龙安柚柚皮果胶的最佳提取工艺为:料液比1∶40、提取液pH值5.0、复合酶(纤维素酶∶木瓜蛋白酶)比例1∶3、酶解温度50 ℃、酶解时间59 min、超声功率70 W、超声提取温度51 ℃、超声提取时间30 min。在工艺条件下,果胶得率平均值为27.43%。