黄连总生物碱通过调控CaMKII减轻局灶性脑缺血(MCAO)大鼠神经功能损伤的研究

李向阳 张晓敏 梁广霞 王 琳 付卫旭 牛宪立

1.遵义医科大学第五附属(珠海)医院肿瘤科，广东 珠海 519100；2.遵义医科大学珠海校区生物工程系，广东 珠海 519041

脑血管疾病是因为脑部血液循环故障引起的，造成对脑组织损伤的一种神经系统疾病，其严重危害了人们健康，临床上主要表现为急性脑血管病，急性脑血管病可分为出血性、缺血性两种，其中缺血性脑血管病约占所有脑血管病的70%～80%[1]。Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaM KinaseⅡ)在脑中含量十分丰富且对中枢正常神经元活动至关重要。短暂脑缺血即可诱发缺血敏感组织该酶活性显著抑制，再灌注后其活性逐渐恢复[2]。大量研究[3]表明，Ca2+/CaM Ⅱ活性抑制与缺血性迟发性神经元死亡(DND)关系密切。黄连(CoptischinensisFranch)为传统中药，黄连素是黄连的主要成分，具有广泛的药理作用[4-5]。有研究[6-7]表明，在个体和细胞水平上都可以保护和修复损伤的神经组织和细胞。黄连可以显著改善大鼠脑缺血/再灌注损伤的神经功能，减小脑梗死灶体积，具有抗脑缺血/再灌注损伤的作用[8-10]。因此，本研究通过建立大鼠MCAO模型，检测黄连对大鼠脑缺血再灌注模型中CaMKII含量的影响，探讨黄连保护缺血性脑损伤的作用机制，为黄连在脑缺血疾病上的临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康成年SD雄性大鼠，6月龄，体重约220 g，由珠海市百试通生物科技公司提供(许可证号：SCXK[粤]2020-0051)。

1.2 脑缺血模型的制备 大鼠麻醉前禁食8 h，自由饮水，腹腔注射10%的水合氯醛0.35 mL/100 g进行麻醉后，依据参考文献[15]，对大鼠颈部总动脉进行结扎，构建脑缺血模型。

1.3 实验组动物神经功能评分 依照Longa 5等制定的评分标准，对模型大鼠进行神经功能评分，从而根据实验需要选择符合要求的模型大鼠。依照Longa的5分法评分标准：0分无明显神经病学症状；1～4分为有效模型，1分为提尾时不能完全伸展前爪，2分行走时向左右侧旋转，3分为行走时向左右侧倾倒，4分不能自由行走。积分越高说明动物行为障碍越严重。评分标准见表1。

表1 Longa 5分法评分标准表

1.4 实验分组与处理 将50只的SD大鼠随机分成5组，每组10只。黄连总生物碱(低浓度 2.5 g/L、中浓度5.0 g/L和高浓度10.0 g/L)治疗组、模型组、假手术组，治疗组用黄连总生物碱灌胃，对照组和假手术组用等量生理盐水灌胃。按照人与大鼠等效剂量关系折算，每只大鼠1 d灌胃两次，每次2 mL，连续灌胃7 d。在最后1次给药12 h之后，对大鼠进行颈椎脱臼法处死，取脑并标记保存。

1.5 TTC染色 在-20 ℃冰箱中取出鼠脑组织，切成2 mm厚度，依次放入十二孔板中，注入2%TTC染液，避光37 ℃恒温孵育20 min，抽出染色液，4%的多聚甲醛固定24 h，通过Imdge-Pro Plus软件测量，正常大脑染成鲜红色，缺血组织出现苍白色。梗死体积(%)=梗死体积/对侧大脑半球体积×100%。

1.6 酶联免疫 吸附测定法(ELISA)检测 CaMKII的含量组织样品在PBS中匀浆后取上清液，CaMKII的含量采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测。根据CaMKII检测试剂盒的操作步骤，封闭后在37 ℃孵箱中孵化1 h。往每孔里加入90 μL的酶作用底物，冲洗、孵育、显色。酶标仪波长为450 nm测量各孔的吸光度(OD值)。各步骤均严格按照试剂盒要求进行。

1.7 测定SOD活力及MDA含量 按上述方法制备组织匀浆，严格按照SOD检测试剂盒和MDA检测试剂盒说明书的操作步骤，酶标仪450 nm读数，得到各孔OD值。

1.8 肝组织病理学观察 将取得的大鼠脑组织用4%多聚甲醛固定12 h、常规脱水、石蜡浸蜡包埋、定形后制作石蜡切片。按照HE染色试剂盒说明书进行苏木精-伊红染色，固定封片后置于光学显微镜下形态学观察神经元病理学变化情况及拍照采图。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能损伤评分和脑梗死体积比较 对SD大鼠MCAO模型构建完成后，以Longa的5分法进行神经功能评分，与假手组相比，模型组评分和脑梗死体积明显升高，各个实验组经过黄连治疗后神经功能评分和脑梗死体积都有明显的降低，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠Longa法评分和脑梗死体积比较结果

2.2 大鼠脑组织匀浆上清液CaMKII的含量测定 对酶标仪检测的结果进行分析，如下表3、图1所示，其中表3是标准溶液倍比稀释液的吸光度值及浓度值，图1是标准溶液倍比稀释液的曲线图，X代表浓度值，Y代表吸光度值，该图的曲线方程为方程：y=(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，其中A=5.48892，B=-1.33598，C=6.85143，D=0.08579，r2=0.99982。测出待测样品的吸光度值，即可通过标准曲线或者标准曲线方程和待测样品的吸光度值，计算出待测样品的浓度。

图1 标准溶液曲线图

表3 标准溶液倍比稀释液的Logistic曲线的数据

表4 各组大鼠脑组织匀浆上清液CaMKII的含量的结果

表5 各组大鼠脑组织匀浆上清液SOD、MDA的含量的结果

对照组的CaMKII的含量(3.547±0.021)ng/mL与假手术组(0.526±0.034)ng/mL相比显著升高(P<0.01)；治疗组中Ca2+/CaMKII的活性[高浓度(0.720±0.044)ng/mL、中浓度(0.863±0.045)ng/mL、低浓度(1.543±0.170)ng/mL]与对照组(3.547±0.021)ng/mL相比明显降低(P<0.05)，而且黄连总生物碱降低CaMKII的含量具有剂量依赖性，其剂量越高，降低效果越明显，与假手术组的值越接近。

2.3 各组大鼠脑组织匀浆上清液SOD、MDA的含量水平比较 模型组与与假手术组比较，模型组大鼠脑组织损伤程度加重，外周血氧化因子SOD活性降低，MDA含量升高；黄连治疗后，低、中、高剂量组氧化因子SOD水平升高，MDA水平降低。

2.4 各组大鼠脑组织HE染色结果 假手术组脑神经元组织结构完整，排列整齐，无明显异常病变。模型组大鼠脑神经元结构发生明显改变，细胞间隙增大，有明显水肿，胞体肿胀变形，胞质中空泡增多，神经元细胞排列紊乱，核仁变浅或溶解缺失，呈现明显的病理学改变。不同剂量的黄连治疗组处理后，各组神经元的病变均有明显的改善，且随着剂量的增大，改善效果越明显，神经元细胞较为规则，排列较为有序，水肿减轻。如图2所示。

3 讨论

脑部血液循环障碍引起的脑血管性疾病，从而造成脑组织损伤的一种神经系统疾病，其严重危害了人们的健康[16]。脑缺氧缺血所引起的损伤除发生在缺血期外，更可能发生在缺血组织再灌注时。后者是由于氧的重新供应，导致氧自由基的产生而引起的[17]。缺氧缺血性脑损伤时，由于氧自由基的大量产生等导致细胞膜Ca2+通道开放，使神经细胞内Ca2+浓度异常升高，进一步干扰了线粒体氧化磷酸化过程，且大量激活钙依赖性酶类使细胞膜结构破坏，同时又产生大量氧自由基，加重细胞损害，从而引起海马细胞的损伤与凋亡。另外被激活的血小板其Ca2+亦增加，可形成微血栓。过量的自由基攻击位于细胞膜中的多不饱和脂肪酸从而引起脂质的过氧化反应，并进一步形成MDA等脂质过氧化物。测定MDA含量能够反映体内脂质过氧化程度，间接反映缺血对细胞造成的损伤[18-19]。

钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)，是Ser/Thr蛋白激酶CaMKS家族中多功能的酶成员，在神经组织广泛分布，参与调节突触的转送过程，形成长时程增强 (LTP)，是介导记忆和学习的关键物质。其次，CaMKⅡ还持有调节靶基因转录等功能。在脑缺血损伤的病理过程中，CaMKⅡ起着格外重要的作用[20-21]。在短暂性脑缺血时，由于钙离子超载，导致CaMKⅡ含量和磷酸化水平异常升高，致使神经组织受到损伤[22-23]。有研究[24-26]表明黄连总生物碱在个体和细胞水平均可保护和修复损伤的神经组织和细胞。从结果可以看出模型组的CaMKII的含量与假手术组相比显著升高(P<0.01)；治疗组中Ca2+/CaMKII的含量与模型组相比明显降低(P<0.05)，且具有一定剂量依赖性。黄连总生物碱可以通过降低局灶性脑缺血大鼠模型中CaMKII含量的作用，CaMKII含量异常升高导致的一系列神经损伤的效果，其机制可能与增加血清SOD活性及降低MDA含量有关。

综上所述，黄连总生物碱通过调控CaMKII可减轻局灶性脑缺血大鼠神经功能的损伤和对脑梗死体积有明显地改善作用，减少了神经细胞的凋亡，其机制可能与脑缺血过程促进了CaMKII的表达，黄连总生物碱可能调控了CaMKII的表达从而减轻氧化应激损伤有关。