水族药南烛根对胫骨骨折大鼠模型血管生成作用的实验研究

曾升友 梁子聪 陆瑞娜 刘 琦 张乐少雄

1.贵州省罗甸县中医医院，贵州 罗甸 550100；2.黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000；3.黔南州人民医院，贵州 都匀 558000

随着国家人口的老龄化和工业交通运输业的发展，临床上骨折的发病率越来越高[1]。丰富的血液供应是骨折愈合的基础，而VEGF是促进血管新生的关键因子[2]。南烛根是杜鹃花科植物乌饭树VacciniumbracteatumThunb.的根[3]，水族民间常将其用于治疗骨折，但其促进骨折愈合的作用机制至今尚未明确。本课题建立胫骨骨折大鼠模型，观察水族药南烛根对骨折大鼠的血管生成作用，探讨其对骨折的治疗作用，为揭示其作用机制提供理论基础。

1 材料

1.1 动物 SD大鼠(清洁级)60只，体重200～220g，雄性。每组分笼适应饲养1周，期间饮水、喂食正常进行，购于湖南长沙天勤生物技术有限公司[动物许可证号SCXK(湘)2019-0014]。

1.2 药材与试剂 水药南烛根中药饮片采自贵州三都水族自治县内，经黔南民族医学高等专科学校第二附属医院民族医学科教授胡建山鉴定为杜鹃花科植物乌饭树VacciniumbracteatumThunb.的根。苏木精伊红液、Masson染液(上海碧云天公司)，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2)免疫组化抗体试剂盒(北京中杉金桥公司)。接骨七厘片(国药准字Z20003140，湖南金沙药业有限公司)，其他均为国产分析纯。

2 方法

2.1 南烛根水提液制备 将南烛根碾碎，以10倍超纯水浸泡0.5 h，煎锅煎煮1.5 h，重复提取2次，混合药液旋蒸仪浓缩至浓度1.5 g/mL，存放 4 ℃ 冰箱备用。

2.2 模型建立及分组 采用锯开法建立大鼠胫骨干骨折模型。所有SD大鼠均以2%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉，以平卧位固定于造模台。碘伏消毒左足至左大腿上段，于胫骨结节下方2 mm沿胫骨脊作1.5 cm纵向切口，剥离外皮，继续沿胫骨脊外侧0.5 mm位置将浅筋膜与深筋膜层纵向切开，游离胫骨前肌群，暴露胫骨外骨面。采用5 mL注射器针头于胫骨髌韧带开口，插入克氏针沿髓腔达胫骨粗隆间，于胫骨中段前方最高点锯开约3 mm左右缺损，缺损达骨髓腔，形成胫骨中段横行骨折。继续插入克氏针穿过骨折位置贯穿整个胫骨髓腔，固定骨折，剪除多余克氏针，将其远端埋于骨皮质下。以0.9%氯化钠溶液冲洗干净后逐层缝合切口，涂抹适量红霉素软膏，连续3 d每天注射8万U青霉素以预防感染。成功建立大鼠胫骨骨折模型后，将大鼠随机分成假手术组、模型对照组，阳性对照组(接骨七厘片 20 mg/kg)、南烛根水提液高、中、低剂量组(400 mg/kg，200 mg/kg，100 mg/kg)，每组10只。建模后第2天起，各给药组按照相应剂量配置溶液灌胃，每天2次。假手术组和模型对照组不给予药物，正常饮食。连续2周。

2.3 镜下病理及血管新生情况观察 处死大鼠后，以骨折位置作为中心，上下各取5 mm×5 mm骨痂组织标本，以4%多聚甲醛固定24 h，组织块常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，制作成厚度5 μm的切片，脱蜡后Masson染色，光镜下拍照，采用Image ProPlus Software 6.0 IPP软件测定新生血管面积百分比(血管面积/截图面积)，在骨痂愈合平面单位视野内随机选取10个不相邻视野，计算每个视野平均值。

2.4 免疫组化法检测骨痂组织VEGF、VEGFR-2阳性表达量 切片常规脱蜡复水后，微波修复，3%H2O2灭活内源性过氧化酶，BSA封闭滴加一抗(VEGF 1∶400，VEGFR-2 1∶400)4 ℃过夜，次日37 ℃复温漂洗后二抗孵育，DAB显色，苏木素复染，经脱水透明后封片，应用image pro图像软件测定骨痂组织VEGF、VEGFR-2阳性表达量。

2.5 统计学分析 应用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数加减标准差表示，多样本资料组间比较采用单因素方差分析及重复测量方差分析，经Levene检验满足方差齐性者，采用单因素方差分析，以最小显著性差异LSD-t检验行两两比较；方差不齐者，采用Welch检验，再以Dunnett T3检验进行两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠骨痂镜下病理观察和血管面积测定结果的比较 假手术组大鼠胫骨骨髓腔内见骨小梁大小、粗细、间隔均匀一致，骨小梁间隔中可见散在血管穿过。与假手术组比较，模型对照组大鼠胫骨骨痂内可见大量的成熟软骨细胞，有丰富的新生微血管，骨小梁较粗、大小不均。与模型对照组比较，南烛根水提液低剂量组、中剂量组镜下表现相似，而阳性对照组和南烛根水提液高剂量组软骨细胞更加成熟，骨小梁粗大、密集，骨小梁间隔可见丰富的血管。如图1。与假手术组比较，模型对照组、阳性对照组、南烛根水提液低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠骨痂血管面积百分比显著增高(P<0.05)；与模型对照组比较，阳性对照组、南烛根水提液高剂量组大鼠骨痂血管面积百分比显著增高(P<0.05)；与阳性对照组、南烛根水提液高剂量组比较，南烛根水提液低剂量组、中剂量组骨痂血管面积百分比明显降低(P<0.05)。详见表1。

A.假手术组；B.模型对照组；C.阳性对照组；D.南烛根低剂量组；E.南烛根中剂量组；F.南烛根高剂量组

表1 大鼠胫骨骨痂血管面积百分比和VEGF、VEGFR-2免疫组化阳性表达结果

3.2 大鼠胫骨骨痂VEGF、VEGFR-2免疫组化阳性表达结果的比较 与假手术组比较，模型对照组、阳性对照组、南烛根水提液低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠骨痂VEGF、VEGFR-2阳性表达显著增高(P<0.05)；与模型对照组比较，阳性对照组、南烛根水提液高剂量组大鼠骨痂VEGF、VEGFR-2阳性表达显著增高(P<0.05)；与阳性对照组、南烛根水提液高剂量组比较，南烛根水提液低剂量组、中剂量组骨痂VEGF阳性表达明显降低(P<0.05)；与阳性对照组比较，南烛根水提液低剂量组、中剂量组、高剂量组骨痂VEGFR-2阳性表达明显降低(P<0.05)。如图1、图2、图3所示。

A.假手术组；B.模型对照组；C.阳性对照组；D.南烛根低剂量组；E.南烛根中剂量组；F.南烛根高剂量组

A.假手术组；B.模型对照组；C.阳性对照组；D.南烛根低剂量组；E.南烛根中剂量组；F.南烛根高剂量组

4 讨论

骨折是临床上骨科最常见的疾病之一。骨折愈合的速度决定了患者回归正常生活的时间，如何促进骨折快速愈合是临床医师共同面对的难题。骨折愈合是一个极其复杂的过程，骨折的早期阶段由间充质干细胞聚集于骨折断端，然后其可分化为纤维细胞、成骨细胞以及原始软骨细胞，是最早骨细胞的来源，促进成骨反应[4]。通过成骨细胞的骨膜成骨和软骨细胞的骨化形成原始骨组织，然后产生软骨基质和无机盐沉淀矿化成骨[5]。新生血管的形成和丰富的血液供应是许多细胞发挥其生长和修复功能的重要因素[6]。研究[7]证明，VEGF可以促进内皮细胞分裂，增加血管通透性，抑制内皮细胞凋亡，促进血管新生。VEGFR-2是VEGF的特异性抗体，两者结合可以诱导新的血管生成。研究显示，通过拮抗剂竞争性与VEGFR结合，从而抑制了VEGF活性，引起小鼠股骨骨折模型愈合障碍[8]。动物骨折模型可以分为开放性和闭合性造模，开放性骨折模型主要是采用切开皮肤及皮下组织后，使用手锯或者侧刀切断骨组织造成骨折，然后根据实验需要固定或者不固定骨折处[9]。闭合性模型大部分使用固定装置固定造模侧肢体，然后利用重物撞击患肢，使得患肢形成骨折，而不破坏皮肤[10]。实验主要观察骨痂处软骨细胞生长及组织因子表达程度，闭合性骨折模型由于动物的体位、肢体固定的角度造成重物下坠时难以控制骨折后形成面积，可能对实验结果造成较大误差，因此本实验选择了锯开法制造大鼠胫骨干动物模型。

南烛根是杜鹃花科植物乌饭树的根，主要分布于贵州、湖南、江西等地，归肝经、肾经，其主要治疗功效为散瘀消肿、强筋止痛。南方民众早有将南烛叶的浸汁做成乌米饭食用，但南烛根用药的报道较少。水族民间常用南烛根熬成药汁用于治疗骨折，疗效明显。研究显示，南烛根浸出物中富含分槲皮素、山柰酚、芹菜素和木犀草素等活性成分[11]。多个动物实验研究结果显示，槲皮素可通过多条信号通路促进BMSCs的增殖和成骨细胞分化，达到抗骨质疏松症和促进骨折愈合的作用[12-14]。本研究结果显示，与模型对照组比较，阳性对照组、南烛根水提液高剂量组大鼠骨痂血管面积百分比和大鼠骨痂组织VEGF、VEGFR-2阳性表达显著增高；镜下病理结果显示，阳性对照组和南烛根水提液高剂量组软骨细胞更加成熟，骨小梁粗大、密集，骨小梁间隔可见丰富的血管。由此说明，南烛根水提液可以通过提高VEGF、VEGFR-2的表达，促进内皮细胞的增生，增加新生血管的数量，从而加速骨折端的愈合。实验中，南烛根水提液低剂量组和中剂量组与模型对照组在血管面积、骨痂组织VEGF、VEGFR-2阳性表达等方面未见明显差异，说明当南烛根水提液达到400 mg/kg可明显促进骨痂组织VEGF、VEGFR-2阳性表达，从而起到治疗作用。

综上所述，水族民间常用南烛根治疗骨折，但由于基础研究和临床报道较少，因此未被广泛应用。经实验研究发现，南烛根水提液可明显促进骨痂组织VEGF、VEGFR-2阳性表达，内皮细胞分裂，促进血管新生，从而达到促进骨折愈合的作用。本实验仅揭示了南烛根通过提高VEGF、VEGFR-2表达的作用，南烛根的其他作用途径仍需下一部实验证实。