神经元特异性烯醇化酶在中枢神经系统损伤中的应用研究进展

齐洪武,曾维俊,刘岩松综述 赵彩霞审校

神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)是一种存在于神经元和神经内分泌细胞中的酸性蛋白酶[1],由Moore和McGregor于1965年首次描述,是糖酵解烯醇化酶的一种分子量为78 kDa的二聚体同工酶,主要存在于神经元的细胞质中,参与慢速轴浆运输。NSE被证明同时具有破坏性和保护性作用,有研究表明它积极参与神经炎性反应、神经变性和神经保护[2];同时NSE还被认为是缺血性脑损伤、创伤性脑损伤、脑卒中、心脏骤停后缺氧脑病、急性脊髓损伤等疾病的生物标志物。文章对NSE在中枢神经系统损伤早期诊断或疾病严重程度及预后评估中的作用进行综述。

1 NSE的分子生物学基础

NSE又称γ-γ烯醇化酶、γ-烯醇化酶或人烯醇化酶2,是烯醇化酶的3种同工酶形式之一[3]。NSE参与糖酵解途径,将2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸。另外2种同工酶形式是α-α烯醇化酶或称非神经元性烯醇化酶(nonneuronal enolase,NNE)、以及β-β烯醇化酶或称肌肉特异性烯醇化酶(muscle-specific enolase,MSE),这3种同工酶在健康生物体中具有特定的分布模式。NNE亚型在胎儿和成年哺乳动物组织中最为丰富,而MSE亚型仅限于骨骼肌,NSE存在于神经元起源的细胞中[4]。

NSE的编码基因名为烯醇化酶2 (enolase 2,ENO2),位于12号染色体上,它由11个编码外显子组成,跨度超过9 213个核苷酸。NNE和MSE的基因分别位于1号和17号染色体上。形成3个同工酶的每个亚基(α、β或γ)的蛋白质链由位于不同人类染色体上的3个不同基因编码[5]。NSE的活性形式为二聚体,由2个非共价连接的亚基组成,它可以作为由2个γ亚基组成的同二聚体存在,称为γ-γ烯醇化酶,也可以作为由α和γ亚基组成的异二聚体存在。γ亚基是一个由433个氨基酸组成的肽,分子量约为39 kDa;α亚基的分子量为48 kDa,蛋白质长度为434个氨基酸残基。γ-γ亚型是神经元的典型特征,而异二聚体α-γ亚型存在于星形胶质细胞和小胶质细胞中[6]。

2 NSE的功能

NSE在广泛的中枢神经系统神经元中具有神经营养特性,可以通过激活磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3激酶(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase,PI3K)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路来控制神经元的存活、分化和轴突再生[7]。此功能是通过该酶C端结构域的PDZ基序与γ-1 syntrophin结合介导的,从而使NSE易位到细胞膜上,这对其神经营养活性至关重要。同时可通过不同刺激如炎性介质、β淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)沉积、Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)依赖模式等促进进程[8]。γ-烯醇化酶激活PI3K还可调节RhoA激酶,RhoA激酶影响肌动蛋白细胞骨架重组、诱导神经突生长和神经元细胞生长停滞,这一过程对于NSE参与神经炎性反应也很重要,因为它导致小胶质细胞的激活[9]。近年来已发现NSE在癌症保护、肿瘤生长和细胞迁移中的作用,肿瘤细胞中NSE水平的增加是对应激条件下癌细胞高能量需求的反应,信号通路的激活被认为促进了癌症的扩散和生长[10]。然而,NSE在这些过程中发挥作用的确切机制尚未完全阐明。

3 NSE在中枢神经系统损伤中的应用

3.1 NSE与创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI) Mozafari等[11]研究发现NSE水平在诊断轻度头部外伤所致脑损伤时的受试者工作特征(ROC)曲线下面积为0.992。此外,以6.97 μg/L为阈值,检测脑损伤的敏感度为0.936,特异度为1.000。这种高度准确的诊断生物标志物可推荐用于评估儿童轻度TBI。中度至重度TBI 常伴有弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury,DAI),考虑到计算机断层扫描检查对微出血和轴突损伤的敏感性低,在急性期使用常规诊断方法难以识别DAI。一项研究发现,入院时的血清 NSE 水平与入院格拉斯哥昏迷评分(Glasgow coma scale,GCS)比值 (NSE level to admission GCS score ratio,NGR)可作为中度至重度TBI患者DAI的独立预测指标,NGR较高的TBI患者更有可能遭受不利的神经学结果[12]。Slavoaca等[13]评估了蛋白质生物标志物S100和NSE与损伤后10 d和90 d的神经认知状态之间的相关性,在 62 例中重度 TBI 患者中,受伤后4 h和 72 h进行2种生物标志物测试,并通过一系列神经认知测试对患者进行评估。结果表明,伤后4h的NSE与中短期神经心理学结果之间存在显著相关性,建议使用该生物标志物来筛选认知功能障碍风险较高的患者。一项前瞻性研究发现,GCS评分≤5分、损伤严重程度评分(ISS)评分>25分、多脏器功能障碍综合征及S100B、NSE、亲环素A(cyclophilin A,CypA)水平升高是影响重度TBI合并谵妄及多发伤转出ICU患者预后的独立危险因素[14]。因此NSE可能是一种敏感而准确的工具,不仅可以评价TBI患者的严重程度和预后,也可以使临床医师更准确地筛查无神经系统体征的颅脑创伤患者。

3.2 NSE与脑卒中 脑卒中是脑血管发生破裂或意外阻塞而导致的急性脑损伤,包括出血性和缺血性卒中。研究发现出血性脑卒中患者的血肿直接压迫周围脑组织,血肿内的炎性物质开始释放,继发出现缺血缺氧,造成神经元损伤甚至坏死,细胞膜通透性增加,NSE透过血脑屏障进入血液[15]。一项回顾性研究探讨了NSE水平与高血压脑出血(hypertensive cerebral hemorrhage,HICH)患者颅内压之间的关系,回顾分析了83例HICH患者的临床资料,所有患者均行有创颅内压探头置入术进行颅内压实时监测。结果发现NSE水平与颅内高压的发生密切相关,血清NSE的水平越高,颅内压越高,对于判断HICH患者是否需要实施开颅血肿清除术具有指导意义[16]。缺血性脑卒中本质上是由于短时间或长时间的缺氧和缺血导致内皮细胞死亡和血脑屏障损伤,损伤脑组织释放的胞质内容物可以穿过血脑屏障,故测定血清NSE水平可能是预测此类脑损伤预后的一种方法[17]。Kurakina等[18]研究发现脑卒中发病后48 h内患者血浆NSE水平与缺血灶体积呈正相关(r=0.49,P=0.003),与神经系统症状的严重程度呈正相关(r=0.33,P=0.02)。急性疾病期NSE低于2 μg/L是脑卒中发作后12～14 d神经功能良好结果的预测指标。Arca等[19]发现症状性新生儿动脉缺血性卒中 (neonatal arterial ischaemic stroke,NAIS) 新生儿脑脊液NSE (cerebrospinal fluid neuron-specific enolas,cNSE)水平与梗死的动脉分布、梗死体积和结局相关联。与大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)-M2-M3-M4 区域的病例相比,多灶性NAIS和NAIS位于MCA-M1动脉区域的新生儿显示出更高的cNSE水平。cNSE水平与相对梗死体积之间存在显著相关性,与发育良好的婴儿相比,具有不良后果的症状性NAIS婴儿的cNSE值更高。cNSE值高于55 μg/L婴儿的不良结果优势比(odds ratio,OR) 值为 6.48。cNSE水平是NAIS潜在的早期预后生物标志物。总体来说,在急性脑卒中的早期阶段,NSE水平的测定较其他诸如影像学检查更为方便和经济,能够较好地评估脑卒中的严重程度、警示颅内高压以及预测结局。

3.3 NSE与脊髓损伤(spinal cord injury,SCI) SCI是常见的中枢神经系统疾病,患者常常产生神经功能缺失以及肢体功能障碍,具有高病死率、高致残率、预后差的特点。SCI进行性病理变化包括复杂的分子级联反应,脊髓神经元和神经胶质细胞被破坏,细胞表面烯醇化酶激活纤溶酶原,纤溶酶原是血清中作为无活性酶原存在的丝氨酸蛋白酶,通过组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)或尿激酶纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogen activator,uPA)转化为活性纤溶酶,并降解细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)蛋白,然后纤溶蛋白降解纤维连接蛋白,穿透内皮,激活基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)[20]。细胞表面烯醇化酶也影响MMPs,MMP-2和MMP-9在炎性反应过程中发挥重要作用,可以帮助将炎性细胞因子TNF-α和IL-1β加工成其生物活性形式,这反过来可能进一步增强炎性反应[21]。MMPs在促炎微环境的产生和维持中发挥重要作用,促炎微环境上调NSE,促进ECM降解,加重缺血性神经病理。因此,针对ECM降解和进行性神经炎性反应的治疗方法可以通过抑制NSE来达成[22]。NSE 对免疫细胞应答、神经元和胶质细胞的下调可能是抑制SCI继发性神经炎性反应的新途径,因此可以靶向烯醇化酶来限制SCI后ECM和MMP介导的损伤。

3.4 NSE与心脏骤停后脑损伤 检测血液中的脑源性标记物可能是最直接和最明显的量化心脏骤停后脑损伤的方法,NSE是欧洲复苏委员会(European Resuscitation Council,ERC)和欧洲危重病医学会(European Society of Intensive Care Medicine,ESICM)目前惟一推荐的标记物[23]。Reuter等[24]对连续接受静脉—动脉体外膜肺氧合技术(vnoarterial extracorporeal membranous oxygenation,VA-ECMO)治疗的难治性心源性休克和院内难治性心脏骤停成年患者进行了研究,发现第3 d血清NSE浓度升高与短期病死率及不良功能结果独立相关。在接受头颅CT检查的患者亚组中,与未患脑卒中的患者相比,诊断为脑卒中患者的NSE浓度显著升高。一项关于血清NSE水平预测心脏骤停后长期不良神经预后的研究,对368例心脏骤停复苏患者 2～6 个月的神经系统结果根据脑功能分类 (cerebral performal cecategory,CPC) 量表进行分析,结果发现NSE阈值在48 h>101 μg/L和在72h>80 μg/L时,预测不良神经系统结果的假阳性率≤2%。而按照最近欧洲复苏委员会(ERC)建议的 48 h和/或72 h>60 μg/L的阈值,则产生了4.3% 的假阳性率(95%CI0.9%～7.4%)[25]。Kang等[26]比较了血清NSE (serum neuron-specific enolase,sNSE)、cNSE和脑脊液 S100B (cerebrospinal fluid S100 calcium-binding protein B,cS100B) 在院外心脏骤停(out-of-hospital cardiac arrest,OHCA)幸存者中的预后表现,这项前瞻性观察研究入组了45例患者,每24h采集一次样本,直至自主循环恢复后72h。在所有时间点,神经功能不良结果组的sNSE、cNSE和cS100B显著高于良好结果组。不良结果组的cNSE和cS100B随时间显著增加(基线与24、48和72 h)。sNSE在24、48和72 h的灵敏度显著低于cNSE或cS100B。cNSE和cS100B与0假阳性率 (false-positive rate,FPR)相关的敏感性在基线时分别为66.6%和45.5%、24h分别为80.0%和80.0%、48h分别为84.2%和94.7%、72 h(FPR,5.0%)分别为88.2%和94.1%。其结论为高cNSE和cS100B是OHCA幸存者神经系统预后不良的强有力预测因素。脑损伤是心脏停搏后神经系统预后不良以及死亡的最主要原因,评估心脏停搏患者能否恢复脑功能是临床决定后续治疗、判断预后的重要手段,目前尚无公认评估心肺复苏术预后标准的NSE标本留取时间以及NSE阈值。

3.5 NSE与心血管术后脑损伤 Kimura等[27]采用中低温停循环联合顺行性脑灌注,分别对 37 例和 23 例患者进行了全弓置换和半弓置换。测量手术前和手术后 1 d抽取的静脉血样本中的血清 NSE 水平。根据神经损伤的严重程度分为无神经功能障碍(n=48)、暂时性神经功能障碍(n=5)、永久性神经功能障碍(n=7)。通过计算机断层扫描或磁共振成像估计脑卒中的程度。研究发现血清 NSE 水平是胸主动脉手术后不良神经系统结局和脑卒中程度的重要预测因子。但也有研究发现NSE不是心血管手术对先天性心脏缺陷儿童神经发育模式影响的可靠神经标志物[28]。由于NSE评估心血管术后脑损伤病情及预后的特异性不高,所以难以独立进行评价,需与其他指标联合。

3.6 NSE与一氧化碳中毒后并发症 迟发性神经精神后遗症 (delayed neuropsychiatric sequelae,DNS) 是一氧化碳中毒 (carbon monoxide poisoning,COP) 的主要并发症,可由炎性反应引起,炎性反应是心脏骤停和卒中时神经元损伤的一种机制。NSE被认为是急性COP中DNS的预测因子,临床上早期识别急性COP患者是否经历DNS对后续治疗至关重要[29]。Nah等[30]研究发现 48 h时间点的NSE水平 >20.98 μg/L 可作为DNS的独立预测因子。Xu等[31]探讨了NSE基因多态性与急性一氧化碳中毒后迟发性脑病(delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning,DEACMP)的关系,结果表明rs2071419和rs3213434是DEACMP的易感位点,NSE rs2071419的 C等位基因和rs3213434的T等位基因以及单倍型GGTTTC和CCTTTC可能是DEACMP的危险因素。在临床急救的过程中,能够反映中毒患者脑损伤程度的特异度及敏感度生化指标至关重要,血清NSE浓度变化可以反映患者中毒严重程度及预后,同时指导临床治疗,尤其对于COP并发症具有较高的临床实用价值。

3.7 NSE与其他神经系统疾病 神经退行性疾病的病理过程导致神经变性并诱导神经胶质细胞活化,导致促炎性细胞因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)的分泌。反应性星形胶质细胞还分泌甲壳质酶蛋白40(chitinase protein 40,YKL-40),刺激细胞迁移,从而维持慢性炎性反应[32]。另外活化的神经胶质细胞通过释放炎性细胞因子来促进神经变性,充当反馈回路。相反,脑脊液中NSE的易位和释放是由于神经元变性引起的,并可能诱导炎性细胞因子的释放[33]。Lee等[34]的研究前瞻性纳入了48例短暂性全面遗忘症(transient global amnesia,TGA)患者,分析了血清NSE水平升高和正常患者之间临床特征的差异。在48例TGA患者中,16例患者 (33.3%) 的血清NSE水平升高 (25.0 μg/L±11.5 μg/L),而32例患者 (66.7%) 的血清NSE水平正常 (12.8 μg/L±2.1 μg/L)。血清NSE水平升高的患者比血清 NSE 水平正常的患者表现出更严重的认知障碍。血清NSE水平在有和没有认知障碍的患者之间显示出相对较高的区分度,曲线下面积(AUC)为 0.684,在临界值为17.3 μg/L 时具有 0.800的敏感度和0.744的特异度。表明神经元细胞功能障碍可能与TGA发病机制有关,此外它可能与认知障碍有关。血清NSE与癫痫发作的时间、频率以及发作后的认知功能有关[35]。Hanin等[36]研究脑损伤生物标志物NSE和S100B是否可以反映脑电图活动并有助于评估癫痫发作风险,结果发现只有NSE水平与脑电图评分呈正相关,NSE水平高于17 μg/L的患者与癫痫发作相关,另外NSE水平增加超过15%与患者的癫痫发作复发相关。β螺旋蛋白相关性神经变性病(Beta-propeller protein-associated neurodegeneration,BPAN)是神经变性与脑组织铁沉积的一种遗传性神经变性病,其典型特征是儿童期非进行性整体发育迟缓和癫痫发作,随后在青春期或成年早期出现进行性神经功能衰退,伴有帕金森病和痴呆症[37]。研究发现血清NSE水平可能是儿童BPAN的诊断生物标志物,但在识别儿童期后患有BPAN的患者方面价值较低[38]。帕金森病(Parkinson's disease,PD)和路易体痴呆(dementia with Lewy bodies,DLB)是常见的神经退行性疾病,tau蛋白、磷酸化tau蛋白(phosphorylated tau,p-tau)和NSE的脑脊液水平可用于区分PD/DLB和非PD/DLB[39]。脑脊液NSE水平在肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)中升高,并可有效区分ALS和脊髓型颈椎病(cervical spondylotic myelopathy,CSM)[40]。脑脊液中NSE和S100含量的联合检测可用于鉴别诊断合并无菌性脑膜炎或化脓性脑膜炎的川崎病(Kawasaki disease,KD),KD合并无菌性脑膜炎比合并化脓性脑膜炎患儿的S100蛋白和NSE水平低[41]。

4 小结与展望

目前对中枢神经系统损伤患者的预后主要基于行为评估、神经电生理评估、神经影像学和临床经验。然而,评估者的主观判断可能会干扰行为评估和临床经验,神经电生理检查易受临床药物干扰,因此,中枢神经系统损伤的预测需要全面的评估。NSE水平变化和中枢神经系统损伤关系密切,检测NSE水平在判断中枢神经系统损伤程度、鉴别诊断、评估预后等方面有很大的临床应用前景,然而由于采集样本的时间点不同、人群异质性以及缺乏长期数据,目前尚无统一和标准化的方案,有待进一步开展研究深入探究。