建兰种子无菌萌发及根状茎增殖分化研究

樊荣辉 叶秀仙 林榕燕 孔兰 林兵 钟淮钦

摘要：以建兰杂交种子为外植体，通过探索果荚采收时间、植物生长调节剂（6-BA、NAA）等关键因子对建兰种子萌发、根状茎增殖与分化的影响，探讨建兰种子无菌萌发及根状茎增殖与分化关键技术。结果表明：果荚最佳采收时期为花后8～10个月，种子萌发的适宜培养基为 1/2MS + 花宝1号1.5 g·L-1+ 6-BA 2.0 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 + AC 0.3 g·L-1；根状茎增殖的适宜培养基为 1/2MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 1 mg·L-1 + AC 0.3 g·L-1，增殖系数达5.34；根状茎分化的适宜培养基为1/2MS + 6-BA 2.0 mg·L-1 + NAA 0.3 mg·L-1 + AC 0.3 g·L-1，分化率达56%。

关键词：建兰；无菌萌发；根状茎；增殖；分化

中图分类号：S682.31                       文献标识码：A                        文章编号：2095-5774（2023）01-0007-04

Study on Aseptic Germination of Seeds and Rhizomes   Proliferation and Differentiation

in Cymbidium ensifolium

Fan Ronghui，Ye Xiuxian，Lin Rongyan，Kong Lan，Lin Bing，Zhong Huaiqin*

（Institute of Crop Sciences，Fujian Academy of Agricultural Science / Fujian Engineering Research Center for Characteristic Floriculture，Fuzhou，Fujian 350013，China）

Abstract：Taking the hybrid seeds of Cymbidium ensifolium as explants，the key techniques of aseptic germination and rhizomes proliferation and differentiation were discussed by exploring the effects of key factors such as harvest time of capsule and plant growth regulators （6-BA and NAA） on seed germination，rhizome proliferation and differentiation in Cymbidium ensifolium. The results showed that the best harvest time of capsule was 8-10 months after flowering，and the suitable medium for aseptic seed germination was 1/2MS + Hyponex No.1 medium 1.5 g·L-1  + 6-BA 2.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1 + AC 0.3 g·L-1；the suitable proliferation medium for rhizomes was 1/2MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 1 mg·L-1  + AC 0.3 g·L-1，and the proliferation coefficient reached 5.34；the suitable differentiation medium for rhizomes was 1/2MS + 6-BA 2.0 mg·L-1 + NAA 0.3 mg·L-1 + AC 0.3 g·L-1，and the differentiation rate was 56%.

Key words： Cymbidium ensifolium；Aseptic seeding；Rhizome；Proliferation；Differentiation

建蘭（Cymbidium ensifolium）又称四季兰，是兰属地生兰的一种，也是国兰最主要的种类之一，以主产地福建命名，是唯一以省份命名的国兰［1］。建兰株型飘逸、花香清幽、花期长，既能赏花又能观叶，是福建省重要特色商品花卉。目前，建兰市场需求量逐步上升，新品种不断推陈出新，但产业规模和产品品质还面临着很大挑战。利用我国丰富的建兰种质资源，开展广泛杂交育种，是培育优异建兰新品种的重要手段。杂交种子的无菌萌发和根状茎增殖是快速获取新品种植株的重要途径。本研究通过筛选建兰果荚采收时间，种子无菌萌发、根状茎增殖与分化的最适培养基，以期为新品种选育提供技术支持。

1 材料与方法

1.1试验材料

建兰种植于福建省农业科学院花卉研究中心温室大棚。以建兰‘君荷与‘怡红双娇杂交获得的果荚为试验材料，果荚中的种子作为外植体进行无菌萌发。

1.2 消毒处理

先将果荚置于洗涤剂中浸泡10 min，流水冲洗30 min，无菌水冲洗2遍，再用75%的酒精进行表面消毒30 s，之后置于0.1％升汞溶液中浸泡消毒10 min，期间轻轻摇晃，消毒结束后，用无菌水冲洗５次。

1.3不同采收时期的种子萌发

分别于人工授粉后6个月、8个月、9个月和10个月进行采收。果荚选取标准为绿色尚未开裂，饱满健康。将消毒后的果荚放入无菌接种盘，无菌纸吸干表面，切开果荚，将种子均匀地撒播在培养基上，每个处理10瓶，黑暗条件下培养。基本培养基为1/2MS，附加NAA 0.2 mg·L-1 + 6-BA 2.0 mg·L-1 + 蔗糖30 g·L-1 + 琼脂5 g·L-1 + 活性炭（AC） 0.3 g·L-1，180 d和240 d后统计种子萌发情况。

1.4 种子的无菌萌发培养

以授粉后9个月的果荚取出种子为材料，基本培养基为1/2MS，以不添加生长调节剂为空白对照，另外添加花宝1号 1.5 g·L-1，或花宝1号 1.5 g·L-1+ 6-BA 2.0 mg·L-1 +NAA0.2 mg·L-1，并附加AC 0.3 g·L-1 + 蔗糖30 g·L-1 + 琼脂5.0 g·L-1，pH值5.8，进行种子无菌萌发，每个配方接种10瓶，240 d后统计萌发数，观察根状茎生长情况。

1.5 根状茎的增殖与分化培养

选择生长状态相近的根状茎，无菌条件下切成0.5～0.8 cm的切段，接种于培养基上，每瓶培养基接种10个根状茎，每个配方接种5瓶。基本培养基为 1/2MS，植物生长调节剂选用 NAA 和 6-BA，NAA浓度为 0.3、1 mg·L-1，6-BA浓度为0.5、1、2 mg·L-1，均附加蔗糖 30 g·L-1 + 琼脂 5 g·L-1+ AC 0.3 g·L-1 。60 d后观察根状茎增殖与分化情况，计算增殖系数和芽分化率，增殖系数=新长出的根状茎数／接种的根状茎数，芽分化率（%）=（分化出芽体的根状茎数／接种的根状茎数）×100%。

1.6 数据处理

应用 Excel 2007对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 不同果荚采收期对种子萌发的影响

果荚采收期对种子萌发的影响如表1所示，花后6个月采收时，种子经暗培养180 d均未产生根状茎，240 d时产生少量根状茎；花后8个月采收时，种子经暗培养180 d和240 d时产生的根状茎数量均有增多；花后9个月时（即种子进入成熟期），萌发的根状茎数量最多；花后10个月时，种子的萌发数量略有下降。以上结果表明花后8～10个月的种子适宜作为外植体。

2.2 不同培养基对建兰种子萌发的影响

建兰种子在培养基上暗培养180 d后陆续有绿色芽点出现，随着培养时间的延长，发育成根状茎。种子在不同培养基中的萌发效率如表2显示，培养基组分影响了建兰种子的萌发效果，种子在无生长调节剂的培养基中的萌发效果最差，在添加花宝1号的培养基中的萌发效果有所提高，添加植物生长调节剂后，即在1/2MS +花宝1号1.5 g·L-1+ 6-BA 2.0 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 + AC 0.3 g·L-1培养基中的萌发效果最好。

2.3 不同植物生长调节剂浓度对根状茎增殖与分化的影响

将种子无菌萌发获得的根状茎作为材料，研究植物生长调节剂NAA和6-BA对根状茎增殖和分化的影响。结果如表3所示，NAA和6-BA浓度配比不同，根状茎增殖和分化差异较明显。在一定范围内，较高浓度NAA和较低浓度6-BA更有利于根状茎增殖，较适培养基为1/2MS + NAA 1 mg·L-1+ 6-BA 0.5 mg·L-1 + AC 0.3 g·L-1，增殖系数达到5.34；较低浓度NAA和较高浓度6-BA更有利于根状茎分化，最适培养基为1/2MS + NAA 0.3 mg·L-1+ 6-BA 2 mg·L-1 + AC 0.3 g·L-1，芽分化率达到56%。

3讨论

建兰种子数量虽多，但因种胚发育不完全，无胚乳，其种皮中又含有抑制萌发的物质，导致自然条件下很难萌发，一般采用无菌培养的方式促其萌发。研究表明，接近成熟的果荚有最高萌发率［2］。本研究通过果荚采收期对种子萌发影响的研究表明，种胚发育不完全不利于种子萌发，随着种胚发育完全，种子萌發速度增快，萌发率逐渐提高，但采集时间较晚的种子，萌发率又会下降，可能与内部形成抑制萌发的物质有关［3］，可初步得出种子萌发率在一定范围内，随种胚成熟度的提高而提高［4］，果荚采收期以8～10个月为宜。采收的种子，以切开果荚轻轻摇动有白色粉末掉落为宜。

植物生长调节剂在兰花组织培养中对根状茎增殖和分化起到非常重要的作用。NAA与6-BA不同浓度配比对根状茎增殖影响也有较大差异，较高浓度NAA更适宜根状茎增殖，其中 NAA 1 mg·L-1+ 6-BA 0.5 mg·L-1为根状茎增殖最适培养基。前人研究结果表明在兰属植物中，较高浓度的6-BA和较低浓度的NAA有利于根状茎分化成苗［5-7］，本试验研究发现，NAA 0.3 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1更适宜根状茎分化，分化率达56%。

参考文献：

［1］刘清涌．中国兰花名品珍品鉴赏图典［M］. 福州：福建科学技术出版社，2004.

［2］杨应华，吴小美. 兰花种子萌发研究［J］. 热带作物科技，1994（3）： 32-34.

［3］黄家林，胡虹．黄花巧兰种子无菌萌发的培养研究［J］. 云南植物研究，2001，23（1）：105-108.

［4］陈春满，叶一枝，凌绪柏. 象牙白花兰种子及茎尖培养与原球茎形态发生［J］. 园艺学报，2002，29（3）： 251-254.

［5］傅雪琳，张志胜，何平，等. 墨兰根状茎绿芽分化的研究机［J］. 华南农业大学学报，2000，21（3）：53-55.

［6］朱根发，叶秀斌，陈明莉，等. 培养基不同成分对墨兰根状茎分化成苗的影响［J］. 中南林学院学报，2003，23（5）：42-44．

［7］王熊，张菊野，连宏坤，等. 素心建兰无性繁殖系的建立及其开花［J］. 园艺学报，1988，15（3）：205-208.

（责任编辑：冯新）