高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定蒺藜中蒺藜皂苷D的含量

廖明丽,李争△,高晗,李亚楠,田方,李军山,2（.神威药业集团有限公司,河北 石家庄 05430;2.云南神威施普瑞药业有限公司,云南 楚雄 675099）

蒺藜药材来源于蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果实，味辛、苦，性微温，有小毒，归肝经，能平肝解郁，活血祛风，明目，止痒[1]。蒺藜含有甾体皂苷、黄酮、多糖、生物碱、氨基酸等成分，以甾体皂苷为主，也是主要的药效成分[2-4]。有研究证实蒺藜皂苷治疗心血管疾病具有明确疗效[5]，此外，还具有降血糖[6]、抗菌、抗肿瘤、性强壮等作用[7]，研究多以蒺藜皂苷元为指标进行考察[8-9]。蒺藜皂苷D属于蒺藜皂苷，有报道称蒺藜皂苷D能抑制肿瘤细胞生长并促进其凋亡[10]，还可改善银屑病皮损处的炎症反应和免疫反应[11]，关于蒺藜中蒺藜皂苷D的含量测定方法报道较少，有文献报道过该成分的含量测定方法，但供试品制备方法极为复杂，需先回流提取、再经过大孔树脂柱进行洗脱[12-13]。本次研究围绕简化药材中蒺藜皂苷D含量测定中供试品的制备方法，建立高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）测定蒺藜中蒺藜皂苷D含量的方法，旨在为更好、更方便地控制蒺藜质量提供可靠的依据。具体报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司），Alltech ELSD-6000型蒸发光散射检测器（美国奥泰科技公司），Sartorius CPA225D型分析天平（德国赛多利斯公司），KH7200DE型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.2 试药 蒺藜皂苷D对照品（批号：112022-201601），购自中国食品药品检定研究院，含量以95.3%计。

蒺藜药材：采购于内蒙、辽宁、吉林等不同的产地，药材经原河北省药品医疗器械检验研究院孙宝惠老师鉴定为蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性 采用的色谱柱为InertSustain C18（250×4.6mm，5μm），以乙腈-水（45∶55）为流动相，柱温为30℃，流速1.0mL/min，使用ELSD-6000型蒸发光散射检测器，进样量为20μL。理论板数按蒺藜皂苷D峰计算应不低于3000。

2.2 对照品溶液制备 取蒺藜皂苷D对照品适量，精密称定，加60%甲醇制成每1mL含51.5μg的溶液，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液制备 取本品粉末（过三号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密量取60%甲醇10mL加入，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按照以上色谱条件，蒺藜皂苷D与相邻峰分离度符合要求，见图1。

图1 HPLC图谱。注：A.蒺藜皂苷D对照品；B.供试品

2.4 线性关系考察 精密吸取配制好的浓度为51.5μg/mL的蒺藜皂苷D对照品溶液，分别取4μL、6μL、10μL、15μL、20μL注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以峰面积（A）的对数为纵坐标y，进样质量（m）的对数为横坐标x，作线性回归分析，得回归方程为Ln（A）=0.5395Ln（M）-6.212，r=0.9996，见表1。实验结果证明，蒺藜皂苷D进样质量在0.206-1.030μg范围内呈良好线性关系。

2.5 精密度试验 精密吸取“2.2”项下的对照品溶液10μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6针，记录峰面积，见表2。

表2 精密度试验

2.6 重复性试验 取同一药材样品粉末6份，按“2.3”项下的方法进行供试品溶液制备，按“2.1”项下色谱条件进行测定，见表3，结果证明，本方法的重复性良好。

表3 重复性试验

2.7 回收率试验 称取已知含量的药材样品粉末（0.0209%）约0.5g，分别精密称定6份，置10mL容量瓶中，精密量取浓度为0.103mg/mL蒺藜皂苷D对照品溶液各1mL加入，加60%甲醇适量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，用60%甲醇定容至刻度，滤过，取续滤液，即得。计算加样回收率，见表4，结果证明本方法回收率良好。

表4 回收率试验

2.8 稳定性试验 精密吸取供试品的溶液20μL，每五个小时进样一次，共五次，记录峰面积，见表5，由结果可知，供试品溶液中蒺藜皂苷D在20小时内稳定。

表5 稳定性试验

2.9 药材含量测定 精密称取6批药材样品，各平行2份，按“2.3供试品溶液制备”项下的方法进行供试品溶液制备，进样量为20μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算含量测定结果，见表6。

表6 各产地药材含量测定结果

3 讨论

文献已报道的蒺藜药材中的蒺藜皂苷D含量测定供试品的制备方法，操作较繁琐，难重现。本实验药材供试品的制备方法为使用60%甲醇溶液，进行超声处理30分钟，提取效果最佳，处理过程简单，使准确度增加，大大节省了供试品的制备时间，节约了成本，降低了能耗。

从6份不同样品的蒺藜药材中蒺藜皂苷的含量测定结果看，各产地差异较大，辽宁产地优于其他两个产地，推测与产地相关，还有可能与药材性状、采收、产地加工等相关[14]，药材样品中有颜色深浅的区别，辽宁产地药材性状明显优于其他产地。

有报道测定蒺藜皂苷的含量多采用蒸发光散射检测器[15]，蒺藜皂苷D无紫外吸收，故本研究采用了蒸发光散射检测器，对蒺藜皂苷D有通用响应，建立了蒺藜皂苷D的含量测定方法。HPLCELSD法准确、简便、灵敏，精密度、重复性、回收率及线性关系良好，可适用于蒺藜药材中蒺藜皂苷D的含量测定。