不同结香方法对土沉香木质部芳香物质形成的影响

庞圣江,周再知,李英健,张 培,李忠国,邓硕坤

(1 中国林业科学研究院热带林业实验中心,广西凭祥 532600;2 南京林业大学,南京 210037;3 中国林业科学研究院热带林业研究所,广州 510520,4 广西大学,南宁 530004;5 广西友谊关森林生态系统国家定位观测研究站,广西凭祥 532600;6 崇左凭祥友谊关森林生态系统广西野外科学观测站研究站,广西凭祥 532600)

沉香是沉香属树种含有油脂的木质部分(俗称“结香”),也是沉香属树种遭遇伤害、真菌侵扰等外界胁迫,产生含有芳香气味用于抵御不良因素的次生代谢产物[1]。沉香具有极高的经济价值,通常应用于高档香料、名贵药材、宗教用品和精细工艺雕刻用品;同时,沉香因其具有独特而优异的香韵气味,令人感觉愉悦舒适,在调节人体心理生理机能方面发挥着重要作用[2]。沉香主要由具有挥发性芳香物质组成,包括色酮类、萜烯类和芳香族类化合物[3-4]。健康的沉香属树种木质部呈白亮色,沉香有效成分少且香味不浓,香农通过利用打洞、砍伤和火烧等传统结香的方法,才能形成少量沉香。人工沉香无论色泽形态、香气活性成分均有别于天然沉香;采用不同的结香方法,沉香属树种结香木质部结构变化、沉香形成时间及其挥发性香气成分亦有差异,潘质洪[5]研究认为激素处理有利于土沉香结香木质部变色面积扩大与芳香物质的积累;Liu等[6]研究表明钻孔诱导土沉香结香,所结沉香品质相对稍好,但其产量低和结香时间长。一些诸如火烧可适当增加沉香产量[7-8],采用激素、无机盐溶液混合处理,土沉香结香时间有所缩短且产量也相对较高[9-10],沉香品质仍然参差不齐。可见,尽管土沉香结香技术丰富多样,还需要继续积极创新和优化结香技术,才能实现生产量大质优的沉香,是人工种植土沉香的最终目的,也是沉香产业发展急需解决的一个重大难题。

土沉香(Aquilariasinensis)木质部的变色范围作为沉香产量的重要指标,通常纵向变色距离较长而横向宽度较窄,淀粉和可溶性糖含量变化,与具有芳香气味的沉香物质形成密切相关[9,11];醇溶性提取物直接决定沉香四醇含量,后者是沉香药材的优劣标志物,《中国药典》规定其不低于0.1%作为药用的质量指标[12];土沉香结香木质部中的苄基丙酮、愈创木醇和2-(2-苯乙基)色酮等主要特征香气成分[13],也已被用作沉香品质评价的重要依据。

试验以12年生土沉香人工林为研究对象,通过设置钻孔、火烧孔和黄绿墨耳菌(Melanotusflavolivens)溶液诱导土沉香结香试验,比较分析各处理的土沉香结香木质部变色范围,淀粉和可溶性糖含量、醇溶性提取物、沉香四醇、挥发性香气成分方面的差异,探讨不同结香方法对土沉香木质部芳香物质形成的影响,为创新和优化土沉香结香技术提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验地位于广西凭祥市热带林业实验中心夏石树木园附近的沉香种植基地(106°89′E,22°11′N)。研究地气候条件为南亚热带季风气候,年平均气温21～23 ℃,年平均降雨量1 060～1 780 mm,无霜期344～362 d,土壤为酸性红壤土,为土沉香适宜栽培区。以12年生土沉香人工林为研究对象,选取长势相对均匀,无严重病虫害植株开展结香诱导处理。土沉香的平均胸径(15.86±0.86) cm、平均树高(7.78±0.26) m。

1.2 试验方法

2021年8月以来,选择晴朗天气,在土沉香人工林试验地内,设置钻孔、火烧孔和黄绿墨耳菌溶液诱导处理,不处理作为对照组。采用完全随机区组排列,每个区组各处理10株,3次重复,共计120株。钻孔处理采用电钻(钻头直径10 mm),在土沉香树体基部 0.5 m 处直至距离树干的第一枝下高处0.5 m,上下洞口相距10 cm处,横向排列钻孔;火烧孔处理则是用直径为12 mm的火烧钢钎,铁锤辅助往土沉香树体钻孔;1 L黄绿墨耳菌溶液用大树营养液袋分装2袋,以输液方式注入土沉香树体进行结香处理。2022年10月,即处理12个月后,每个处理随机取样5株,于土沉香树体钻孔上下1～3 cm处的凿取适量结香木质部,取样后用锡箔纸包好拿回实验室自然晾干,粉碎研磨成细粉末。每次称取过40目筛的沉香粉末,检测相关指标。

1.2.1 土沉香木质部组织变色范围

土沉香经过打孔、火烧孔和菌液一定时间处理,结香木质部有明显的含油性沉香物质,且具有特殊的芳香气味,浅色区(变色材)、深色区(沉香材)界限明显,剥去树皮和白边材,可直接初步判别土沉香木质部变色情况(图1)。取样时,土沉香剥皮和用勾刀刨去外围一部分白边材,采用直尺和电子游标卡尺,分别测量浅色区、深色区的横向宽度(处理孔为中心,沿左、右方向的宽度)、纵向长度(处理孔为中心,沿上、下方向的长度)[9,11]。

图1 3种结香技术获得的土沉香标本Fig.1 A. sinensis samples obtained from three agarwood-induction technique treatments

1.2.2 淀粉和可溶性糖含量

取样前于土沉香钻孔上方3.0～5.0 cm处钻取结香木质部小木块,锡箔纸包好放入液氮里速冻。当天将样品带回实验室,用液氮磨成粉并置于-80 ℃温冰箱临时保存,蒽酮-硫酸比色法和硝酸钙法测定淀粉和可溶性糖含量[9]。

1.2.3 醇溶性提取物测定

根据林业行业标准LY/T 2904—2017《沉香》方法[14],采用电子称准确取2 g沉香粉末,用体积分数95%乙醇(色谱纯)超声波提取 2 h,静置3～5 min后,过0.45 μm滤膜获取悬浮液,重复提取3次,待液体挥发至恒重,称其质量计算醇溶性提取物含量[15]。

1.2.4 沉香四醇和挥发性成分

按照1.2.3节操作步骤,每次提取10 mL乙醇提取物,溶剂挥发后用乙酸乙酯定容2 mL,过滤干燥后,在广西大学林产品质量检测中心采用GC-MS(日本岛津),DB-5ht专用色谱柱(250 m×4.6 mm,5 μm),对待测样品进行沉香四醇和挥发性成分测定。

沉香四醇:根据2020版《中华人民共和国药典》测定沉香四醇含量,沉香四醇标准品浓度为30 μg/mL(由中国食品药品检定研究院提供),采用LC-20A液相色谱仪(日本岛津),色谱柱:C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),检测沉香四醇含量。

挥发性成分:称取2 g沉香粉末,按步骤1.2.3节的操作获取乙醇提取物,进行GC-MS上机检测挥发性成分。色谱条件:升温程序,起始温度90 ℃保持1 min后,以5 ℃/min升温至150 ℃,保持5 min;再以 5 ℃/min 的升速至260 ℃,保持10 min。进样口温度250 ℃;载气为高纯He(99.999%),载气流量0.5 mL/min,进样量1 μL,溶剂延迟4 min。质谱条件:离子源接口温度为250 ℃,电离方式 EI;电子能量70 eV,质量扫描范围35～350 m/z。

利用 GC-MS Postrun Analysis软件,根据色谱峰的保留指数和质谱碎片信息检索 NIST 谱库(2014),确认化学成分。采用沉香四醇的保留时间作为基准,对GC-MS总离子流图和HPLC中的色谱峰进行保留时间校正,用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件,寻找共有峰并计算峰面积[16]。

1.3 数据处理

用SPSS 20.0对数据进行ANOVA方差分析,Duncan法进行多重比较,用Origin 2021绘图。

2 结果与分析

2.1 土沉香木质部组织变色范围

从表1可以看出,3种结香方法对土沉香结香木质部变色范围的影响各异,对照组土沉香木质部未结香均为白边材。从土沉香结香木质部变色大小范围来看,黄绿墨耳菌溶液处理>火烧孔处理>钻孔处理。

表1 土沉香木质部组织横向和纵向变色范围

其中,黄绿墨耳菌溶液处理土沉香木质部(沉香材部分)变色范围最大,纵向变色距离最长达120.02 cm,横向变色距离最宽达3.84 cm,离输入孔越近深色区域范围越大。钻孔和火烧孔诱导土沉香木质部变色范围,持续存在没有规律性的变色材和沉香材;沉香材纵向变色距离均超过110 cm,但横向变色距离最宽仅为0.58 cm和1.06 cm,而后者变色范围优于前者处理。

2.2 土沉香木质部组织淀粉和可溶性糖含量

从图2可以看出, 3种方法处理的土沉香结香木质部淀粉含量均显著低于CK处理(P<0.05),降幅范围为24.82%～55.25%;其中,黄绿墨耳菌溶液处理土沉香结香木质部淀粉含量降幅最大,火烧孔处理次之,钻孔处理降幅最小。此外,黄绿墨耳菌溶液和火烧孔处理土沉香结香木质部可溶性糖含量均显著高于CK处理(P<0.05),钻孔处理与CK处理差异不显著(P>0.05),三者涨幅范围为23.76%～46.87%;其中,黄绿墨耳菌溶液处理土沉香结香木质部可溶性糖含量涨幅最大,火烧孔处理次之,钻孔处理涨幅最小,说明不同结香方法处理后,土沉香结香木质部淀粉出现不同程度的消耗,促进了可溶性糖转化积累,黄绿墨耳菌溶液处理效果最为明显。

柱状图上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。图2 土沉香木质部组织淀粉和可溶性糖含量Different lowercase letters indicate significant differences among treatments (P<0.05). The same as below.Fig.2 Starch content and soluble sugar content of xylem tissue of A. sinensis

2.3 土沉香醇溶性提取物和沉香四醇含量

从图3可以看出,钻孔、火烧孔和黄绿墨耳菌溶液处理的土沉香样品醇溶性提取物含量分别达到11.84%、13.26%和21.08%,均显著高于对照处理(P<0.05)。各方法诱导处理的所有土沉香样品醇提物含量在11.84%～21.08%之间,均达到林业行业标准LY/T 2904—2017《沉香》鉴定标准,但醇溶性提取物含量却各有差异。其中,黄绿墨耳菌溶液处理效果最优,与其他处理均存在显著差异(P<0.05);钻孔和火烧孔处理的效果次之,二者之间的差异不显著(P>0.05),说明黄绿墨耳菌溶液处理更有利于提高沉香醇溶性提取物含量。

图3 土沉香木质部组织醇溶性提取物和沉香四醇含量Fig.3 The alcohol soluble extractive content and agarotetrol content of xylem tissue of A. sinensis

3种方法处理的沉香四醇含量分别达到0.18%、0.26%和0.42%,CK处理未检测出沉香四醇。各诱导处理的所有沉香四醇含量在0.18%～0.42%之间,均超过2020年版《中国药典》所规定的0.1%含量标准。根据沉香四醇含量高低顺序依次为黄绿墨耳菌溶液处理>火烧孔处理>钻孔处理,且各处理间存在显著差异(P<0.05)。由此可见,黄绿墨耳菌溶液处理更有利于提高沉香四醇含量。

2.4 土沉香香气挥发性成分

通过GC/MS方法分析结果发现,3种方法处理的土沉香结香木质部芳香物质形成过程中,共鉴定出46种主要挥发性香气成分(表2)。

表2 结香诱导处理所得土沉香主要挥发性香气成分

钻孔处理土沉香芳香物质中共鉴定出29种成分,占总峰面积的66.79%;主要成分包括色酮及其衍生物(16.40%)、沉香螺醇(7.35%)、愈创木醇(6.34%)、香树烯(5.49%)、苄基丙酮(5.47%)、二氢卡拉酮(5.28%)和枯苏醇(3.59%)。火烧孔处理土沉香芳香物质中共鉴定出 33种成分, 占总峰面积的70.92%;主要成分是色酮及其衍生物(16.58%)、沉香螺醇(8.67%)、愈创木醇(7.45%)、二氢卡拉酮(5.52%)、香树烯(5.24%)、枯苏醇(4.26%)、苄基丙酮(4.23%)和α-檀香醇(3.05%)。黄绿墨耳菌溶液处理土沉香芳香物质中共鉴定出36种成分,占总峰面积的76.78%;主要成分是色酮及其衍生物(21.87%)、沉香螺醇(8.56%)、愈创木醇(8.32%)、苄基丙酮(6.82%)、二氢卡拉酮(3.06%)、香树烯(2.83%)、枯苏醇(2.82%)和壬醛(2.81%)。

3 讨 论

本研究中钻孔、火烧孔和黄绿墨耳菌溶液处理,对土沉香结香木质部变色范围的影响各异;其中,以黄绿墨耳菌溶液处理的变色范围最大,深色区(沉香材)纵向变色距离最长达120.02 cm,横向变色距离最宽达3.84 cm。钻孔或火烧孔的变色范围较小,属于没有规律性的沉香材。这与其他方法的土沉香结香,出现类似心材变色现象有一定相似性[9,17],尤其是菌液处理之后通过蒸腾作用,向上输导所引起土沉香树体防御反应,更有利于木质部芳香物质的积累。有学者研究认为,有色物质大多数来源于含氧酚羟基或者碳基,这些助色自由基与土沉香结香木质部变色有密切关系,主要通过淀粉代谢经由可溶性糖类化合物转化而来[18-19]。

本研究表明,3种方法处理土沉香结香木质部淀粉和可溶性糖含量(除钻孔)均显著低于CK处理(P<0.05)。其中,菌液处理的淀粉含量降幅最大,火烧孔处理次之,钻孔处理降幅最小;可溶性糖含量在这些组织结构内增加,增幅则相反之。前人研究认为可能与人工诱导土沉香树体所产生的生理响应有关[20-21],木质部淀粉加速转化为可溶性糖,增强自身代谢能力,利于具有芳香气味的物质形成以抵御外界胁迫。

3种方法处理土沉香的醇溶性提取物含量分别达到11.84%、13.26%和21.08%,显著高于CK处理(P<0.05)。也高于半截干或接菌处理1年左右土沉香[22],通体结香技术处理为11.15%～24.02%[23],与本研究结果基本一致,说明不同方法处理土沉香的醇溶性提取物含量各有差异。3种方法处理的沉香四醇含量分别达到0.18%、0.26%和0.42%,这与其他人工促进土沉香结香,检测的沉香四醇含量无明显差别[24]。总体上来看,本研究3种方法处理1年后,沉香四醇含量均超过0.1%的药用标准,这可能与土沉香结香的时间有关,积累时间越长沉香品质才更优质。

研究显示,3种方法处理的土沉香结香木质部芳香物质主要是色酮及其衍生物(16.40%～21.87%)、沉香螺醇(7.35%～8.56%)、愈创木醇(6.34%～8.32%)、香树烯(2.83%～5.49%)、苄基丙酮(4.23%～6.82%)、二氢卡拉酮(3.06%～5.52%)和枯苏醇(2.82%～4.26%)。而采用生物接菌、火烧和化学刺激法诱导处理[25-27],所得沉香螺旋醇、沉香呋喃、白木香醛、苄基丙酮、对甲氧基苄基丙酮和矛苍术醇是沉香主要芳香物质,与本研究结果有所差异。与2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮、沉香螺醇、愈创木二烯-15-醛、二氢卡拉酮和雪松醇是马来沉香(A.malaccensis)主要芳香物质也有一定区别[28-29]。可见,土沉香结香木质部芳香物质的化学成分及其相对含量方面的差异,可能与沉香属树种、结香方法、结香时长和遗传因素存在密切关联[30-31]。

土沉香结香木质部芳香物质中,色酮及其他衍生物、沉香螺醇、二氢卡拉酮和枯苏醇带有木质和坚果香气,是最具有强烈的芳香活性成分之一。这与马来沉香、近全缘沉香(A.subintegra)和柯拉斯那沉香(A.crassna) 挥发性香气成分研究结果[32]相似,是土沉香芳香物质的重要成分。另外,一些诸如白木香醛、二氢沉香呋喃、雅榄酮、缬草烯醛、愈创木-4,11-二烯和α-布藜烯等低浓度香气物质,也有助于提升沉香香韵气味。3种方法处理土沉香所含的苄基丙酮、榄香素、4-苯基-2-丁酮、缬草-4,7(11)-二烯和香木兰烷的香气贡献率也比较大,甜果香、花香和药草香归因于该类物质存在;壬醛、环氧异香橙烯、香树烯、丁酸丁酯、4-叔丁基间二甲苯和间二甲苯是甜香的主要香气来源,说明沉香香气是不同挥发性成分的气味物质之间的平衡。