基于叶绿体基因组数据的芸香科属间系统发育初步分析

刘 涵,孙 冲,吴 杰,黄 威,黄勤琴,刘 霞,4*

(1 重庆文理学院 园林与生命科学学院,重庆 402160;2 重庆三峡学院 生物与食品工程学院,重庆 404000;3 长江大学 园艺与园林学院,湖北荆州 434025;4 西南大学 园艺与园林学院,重庆 400799)

芸香科(Rutaceae)中许多植物以具重要的药用、经济和观赏价值而闻名,如花椒属(ZanthoxylumL.)物种[1]。芸香科从属于芸香目(Rutales),约150属,1 600种,分布于世界各地,中国有28属,约151种,28变种,主要分布在中国西南和南方地区[2]。基于分子系统研究结果表明,芸香科是单系类群[3];然而,芸香科下亚科的划分争议较大。被子植物分类系统(angiosperm phylogeny group,APG)将芸香科划分为芸香亚科(Rutoideae)、柑橘亚科(Aurantioideae)、戟叶橄榄亚科(Cneoroideae)和脂檀亚科(Amyridoideae)4个亚科。根据果实和雌蕊形态,Engler系统将该科细分为芸香亚科、柑橘亚科、飞龙掌血亚科(Toddalioideae)、巨盘木亚科(Flindersioideae)、Rhabdodendroideae、Dictyolomatoideae和Spathelioideae 7个亚科[4],其中仅前4个亚科在中国有分布。

前人研究表明,物种多样性最高的芸香亚科和飞龙掌血亚科物种关系很大程度上是混杂的,芸香科的模式属芸香属与柑橘亚科关系更为密切[5-6]。Poon等[7]通过2个叶绿体片段和核基因标记表明吴茱萸属(TetradiumLour.)、黄檗属(PhellodendronRupr.)和飞龙掌血属(ToddaliaJuss.)是花椒属的近亲属。Poon等[7]和Groppo等[8-9]发现花椒属与飞龙掌血属为姊妹类群,而黄檗属则嵌套在吴茱萸属中。Appelhans等[1]根据5个叶绿体和核基因标记,认为飞龙掌血属可能嵌套在花椒属内。尽管前人对芸香科植物做了大量的研究,但仅使用有限数量的叶绿体和核基因标记来推断该科的系统发育关系,系统发育树中一些重要节点的分辨率较低。目前,在更广泛的分类群采集和大量分子数据使用的基础上,尚没有得到1个完整的芸香科系统发育树框架。此外,由于系统发育树支持率较低,以及在以往研究中使用的分子标记有限,花椒的近亲属还有待进一步阐明。完整的叶绿体基因组(chloroplast DNA, cpDNA)序列为系统发育特征提供了丰富的生物信息,有助于深入了解芸香科亚科之间以及花椒属及其近缘属之间的进化关系。

叶绿体基因组大小适中,基因含量和结构相对保守,核苷酸替代率低,为植物进化和系统发育研究提供了充足的资源[10],已有研究证明叶绿体基因组序列具有在不同分类水平上解决系统发育关系的潜力[11]。近年来,叶绿体基因组被用于不同分类水平的分析,例如,李岩等[12]基于叶绿体基因组数据比较分析了十字花科(Brassicaceae Burnett)22个属22个物种的系统进化关系,结果表明利用叶绿体基因组数据可以解决十字花科植物的系统分类和系统发育关系。路东晔等[13]分析了臭柏(JuniperussabinaL.)叶绿体基因组结构特征及系统进化关系,丰富了臭柏的遗传信息。Xu等[14]基于叶绿体基因组序列建立了风毛菊属(SaussureaDC.)系统发育框架,各分支具有较高支持率。Zong等[15]利用叶绿体基因组序列解析了杨属(PopulusL.)物种的亲缘关系。段义忠和张凯[16]对沙冬青[Ammopiptanthusmongolicus(Maxim. ex Kom.) Cheng f.]和矮沙冬青[Ammopiptanthusnanus(Maxim. ex Kom.) Cheng f.]叶绿体基因组进行了测序,分析了其叶绿体基因组结构和系统发育关系,为沙冬青属的种间鉴别和分子标记的开发等奠定了理论基础。马孟莉等[17]对姜科(Zingiberaceae)豆蔻属(AmomumRoxb.)阳春砂(AmomumvillosumLour.)叶绿体基因组进行了测序,揭示了阳春砂与其他姜科植物的进化关系。Wen等[18]报道了野木瓜(StauntoniachinensisDC.)叶绿体基因组序列,并对木通亚科(Lardizabaloideae)植物的叶绿体基因组进行比较分析,揭示了其适应性进化。本研究对芸香科中12个物种进行了叶绿体基因组测序,组装和注释,获得其叶绿体全基因组序列,结合数据库中已公布的芸香科物种的叶绿体基因组序列,共46个物种,选择苦木科(Simaroubaceae)和橄榄科(Burseraceae)共3个物种作为外类群,对分布于中国的芸香科植物进行了分子系统发育分析。由于巨盘木亚科物种材料和叶绿体全基因组数据的缺乏,该亚科未纳入本研究中。利用叶绿体基因组数据对中国芸香科属水平的亲缘关系进行了系统发育重建,有助于加深理解中国芸香科属间系统进化关系,同时明确花椒属的近缘属类群,为下一步进行花椒属种间的系统进化关系研究选择合适外类群提供数据参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

研究共获得芸香科46个物种的叶绿体全基因组序列,其中12个物种为本研究新测序获得,序列登录号及详细的样品信息见表1。

表1 研究所用样本的信息

其余物种包括3个外类群物种的叶绿体全基因组序列均从GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)数据库获得。植物标本存放于重庆文理学院园林与生命科学学院。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取和测序

采用CTAB法[19]或植物基因组DNA植物试剂盒(天根生化科技有限公司)提取植物硅胶干燥叶片的总基因组DNA。质检合格后的DNA,送广州佰数生物科技有限公司在BGISEQ-500平台进行测序,双末端测序读取长度为150 bp。

1.2.2 叶绿体全基因组的组装和注释

为保证后续组装质量,对测序获得的原始数据(raw data)进行过滤,去掉带接头的reads,去掉N含量超过10%的短序列,过滤测序质量值小于Q20,对过滤后的reads用SPAdes Assembler v3.9.0软件[20]组装叶绿体基因组,使用GapCloser v1.12软件对组装后的结果进行补洞和碱基校正,在Chlorobox[21]中使用CpGAVAS[22]软件进行基因组注释。使用MAFFT v7.0软件[23]进行序列比对。

1.2.3 系统发育树构建

系统发育树重建分别采用最大似然法(maximum likelihood,ML)和贝叶斯法(bayesian inference,BI),ML分析用RAxML v 8.2.12软件[24]进行,使用jModeltest 2.0软件[25]确定最佳核苷酸替代模型为GTR+G+I,按照AIC(Akaike information Criterion)信息标准检测模型对数数据的拟合程度。采用MrBayes v.3.2.1[26]进行BI分析。马尔可夫链蒙特卡罗(MCMC)算法运行1 000万代,每1 000代取样1次,运行结果前25%作为burn-in,其他参数设置为默认值。

2 结果与分析

2.1 叶绿体全基因组特征

新测序的花椒属物种组装好的叶绿体基因组全长范围在157 304(两面针)～159 072 bp(野花椒)之间,具有典型的四分体结构,包括大单拷贝区、小单拷贝区和2个反向重复区。花椒属物种叶绿体基因组除川陕花椒包含133个基因,其余均包含132个基因,GC含量均大于38%,柑橘、吴茱萸和川黄檗叶绿体基因组长度分别为160 698 bp、158 762 bp和158 490 bp。对所获得的49个物种的叶绿体基因组序列进行比对,用于进化分析的叶绿体基因组序列总长度为196 641 bp,叶绿体基因组序列具有26 747个变异位点,其中12 670个是简约性信息位点。

2.2 芸香科间系统发育关系分析

2种方法ML和BI构建的系统发育树具有相同的拓扑结构,仅在某些进化支的支持率(PP/BS)上存在差异(图1)。基于叶绿体基因组数据构建的系统进化树各分支分辨率较高,这可能与叶绿体基因组序列含有较高的生物信息位点有关,从而获得了芸香科物种间稳健的系统发育关系。芸香科物种聚为1个单系类群,科下物种进一步分为两大分支,其中单系的柑橘亚科与芸香亚科的芸香属聚为1个分支,芸香亚科和飞龙掌血亚科聚为另一分支,该两亚科均不是单系,其中飞龙掌血亚科的香肉果属,茵芋属与芸香亚科的白鲜属,臭常山属是最早分化出来的类群,其次是蜜茱萸属和山油柑属。

支持率(BS/PP)<100或<1显示在分支的上方。图1 基于叶绿体基因组数据重建的芸香科系统发育树Support values (BS/PP) either <100 or <1 are shown above the branches.Fig.1 Phylogenetic tree of the Rutacese based on the chloroplast genome data

芸香亚科和飞龙掌血亚科之间的系统发育关系很大程度上是混合的,模式属芸香属既不属于芸香亚科也不属于飞龙掌血亚科,而是与柑橘亚科的关系更为密切,这与其他的系统发育分析结果基本一致。

2.3 花椒属及其近缘属间的系统发育关系分析

所有的花椒属物种聚为1个单系(BS=100%,PP=1)。黄檗属和吴茱萸属与花椒属(Zanthoxylum)类群形成姊妹关系(BS=100%,PP=1),飞龙掌血嵌套于花椒属内,这与Appelhans等[1]研究结果一致,2个属应该进行合并。来自印度洋群岛的2个花椒物种(Z.madagascariense和Z.paniculatum)最早分化出来,为花椒属物种的基部类群,飞龙掌血属物种飞龙掌血嵌套于花椒属分支中,与尖叶花椒、石山花椒、青花椒和来自南太平洋群岛汤加的Z.pinnatum物种形成姊妹关系。来自南太平洋群岛的Z.tragodes位于另1个亚分支的基部,与其他花椒物种形成姊妹关系,各分支有较高的支持率。

3 讨 论

根据进化树,芸香亚科和飞龙掌血亚科之间的关系很大程度上是混合的,模式属芸香属不属于芸香亚科和飞龙掌血亚科,而与柑橘亚科关系更密切(图1)。芸香亚科、飞龙掌血亚科和柑橘亚科的系统发育关系很大程度上不符合根据形态来定义芸香科植物的恩格勒分类体系[4]。该研究的结果与最近基于几个叶绿体和核基因标记重建的芸香科系统发育树结果[5-6]基本一致,但该研究的系统发育树具有相对较高的支持率。因此,传统的亚科分类并不能反映芸香科的系统进化关系。最近,有研究学者提出将柑橘亚科、巨盘木亚科、芸香亚科和飞龙掌血亚科合并。其中,柑橘亚科、芸香亚科和飞龙掌血亚科之间的关系非常密切,该研究的分子系统研究证实了这一点。遗憾的是,在该研究中没有收集到巨盘木亚科的材料,为了全面解决中国芸香科的分类学问题,在未来的分析中还需要加入巨盘木属(Flindersia)物种。

黄檗属(Phellodendron)、吴茱萸属(Tetradium)和飞龙掌血属(Toddalia)曾一直被认为是花椒属的近亲属,并形成1个单系分支[8]。Poon等[7]和Groppo等[8]指出,花椒属和飞龙掌血属是姊妹类群关系,而黄檗属则嵌套在吴茱萸属内。该研究结果表明,黄檗属和吴茱萸属形成1个亚分支,彼此形成姊妹关系。虽然黄檗属和吴茱萸属在果实结构上有很大的不同(前者是开裂的蓇葖果,后者是肉质核果),但Hartley[27]发现根据植物营养物质或雄蕊材料是不可能区分开这2个属。先前的分子研究也表明这2个属有密切的亲缘关系[7,28]。在本研究中,基于叶绿体基因组数据构建的系统进化树也支持黄檗属和吴茱萸属的姐妹群关系(BS=100%,PP=1)。花椒属和单属单种的飞龙掌血物种形成另1个亚分支(BS=100%,PP=1)。花椒属和飞龙掌血属的相似性不仅得到了分子数据的支持,而且化学特征[7,28]也表明二者具有较近的亲缘关系。在过去的分子系统发育研究中,飞龙掌血属被认为可能与花椒属是姊妹关系,或者嵌套在花椒属内[29]。此外,Appelhans等[29]提出将飞龙掌血(Toddaliaasiatica)的拉丁名改为Zanthoxylumasiatica(L.) Appelhans,Groppo &J.Wen,comb.nov。该研究结果表明,飞龙掌血(T.asiatica)嵌套在花椒属内,证实了飞龙掌血属是花椒属谱系的一部分,支持将这2个属合并。

该研究利用高通量测序技术完成了芸香科12个物种叶绿体基因组测序、组装和注释,并基于叶绿体基因组数据获得了高分辨率的芸香科下及关键属间的系统发育树,虽然丰富了芸香科的遗传资源,加深了对芸香科植物系统发育关系的理解,但遗憾的是,在该研究中未包括巨盘木亚科物种的材料,基于叶绿体基因组数据构建芸香科植物的系统进化关系还不够全面,在以后研究中需要加入该亚科的物种,利用更多的基因组数据来挖掘和完善芸香科的系统进化关系。