果蝇脂肪体中Piwi影响生长发育的新功能鉴定

李广莹, 肖桂然, 吴 磊, 闫永平, 纪晓雯, 金 礼

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

Piwi(P-element induced wimpy testis)属于Argonaute 蛋白家族,特异性表达于生殖细胞中[1],通过与piRNA(Piwi-interacting,RNA)进行结合,形成piRNA沉默复合物(piRNA-induced silencing complex,piRISC),以维持基因组中转座子的正常沉默状态,防止转座子爆发而引起相应基因的改变,对生殖细胞的发育和维持基因组的完整性及稳定性意义重大[2-4]。研究表明,Piwi蛋白在哺乳动物和其他昆虫生殖系统内也有表达[5-6],在多种生物中表现出高度保守的结构和功能特点[7]。Piwi/piRNA对转座子转座的调控方式是多方面、多层次的,若Piwi蛋白发生突变或 piRNA通路受阻,则会使生殖细胞发育受到严重阻滞[8]。另有研究表明,Piwi在其他器官和组织如脂肪体中也有少量分布,但很少有关于piRNA与Piwi在脂肪体中功能的研究[9]。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是机体细胞正常代谢的产物,是一类大分子,属于自由基[10],具有重要的生理功能,比如激活胞浆内的第二信使参与细胞信号转导[11]。线粒体内膜上的电子传递链是ROS合成的主要场所,正常细胞所产生的ROS中有95%均来源于此[12]。但高浓度的ROS具有细胞毒性,当机体受到内外环境刺激后,会产生大量的ROS分子,其中包括超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等,这些分子具有极强的氧化能力,破坏细胞内氧化还原系统的平衡,引起氧化应激,攻击DNA、蛋白质和脂类等生物大分子,给细胞带来严峻的考验[13-15]。因此,ROS过量积累会严重干扰相应组织的正常功能。

作为四大经典模式生物之一的黑腹果蝇,已经广泛应用于遗传、发育、生理和行为等领域[16]。原因在于它具备如下优良特性:果蝇易于培养、生长迅速、繁殖速度快;染色体数目少,但突变性状多,已构建多种基因型的突变体;相关技术成熟,易于进行遗传上的操作[17-18]。此外,果蝇与哺乳动物在许多方面具有相似性,比如类似的组织和器官结构,其中果蝇的脂肪体(fat body)相当于哺乳动物的脂肪和肝脏[19]。另外,果蝇具有许多哺乳动物相关蛋白的同源物[20],因此可利用模式生物果蝇对Piwi蛋白在脂肪体中的功能进行研究。

本实验主要研究脂肪体中的Piwi对机体生长发育的影响。研究表明,在脂肪体敲低Piwi的表达,脂肪体的储存代谢受损,进而影响到果蝇的生长发育,包括羽化率降低、生长周期延长、寿命缩短。进一步的研究表明,敲低Piwi基因会诱导ROS大量生成,导致细胞内代谢紊乱,从而对脂肪体的功能造成损伤。本研究对Piwi调控相关疾病的发生具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

GAL4-UAS系统是实现果蝇体内基因特异性敲低的常用手段,该系统由driver(GAL4)和responder(UAS)2个调控元件组成,分别存在于2种转基因果蝇中,2种果蝇杂交产生的后代同时含有这2种元件,GAL4启动UAS下游基因细胞的组织特异性表达。

由于布置挡板会导致风室局部阻力增大，相应增加风机负荷，造成风机功率降低，增加电耗。因此在研究炉排横向配风不均匀时需要考虑风室的阻力及阻力造成的电耗损失。模拟结果如图9、图10所示。

本研究所用的GAL4驱动子是Cg-GAL4,该果蝇来自Bloomington Drosophila Stock Center,它能特异地在果蝇的脂肪组织中表达,实验中利用该驱动子实现脂肪体中特异性敲低Piwi基因;研究中所用到的对照组果蝇品系为野生型和Piwi-RNAi 2个品系的果蝇,均来源于Vienna Drosophila Research Center(VDRC)。

1.2 实验仪器

酶标仪(澳大利亚INFINITE M NANO);倒置荧光DIC显微镜(日本Nikon)。

1.3 方法

1.3.1 果蝇饲养条件

根据甘油三酯测试盒(南京建成生物工程研究所,货号A110-1-1)的使用说明,对细胞内甘油三酯水平进行检测。

庞朴先生指出，大概到春秋时期，“五行”已经逐步由具体的物质抽象为具有统摄性的物质“属性”［14］，例如在《左传·昭公二十九年》蔡墨对魏献子的答辞中，蔡墨提出：“有五行之官，是谓五官。……木正曰句芒，火正曰祝融，金正曰蓐收，水正曰玄冥，土正曰后土。龙，水物也。水官弃矣，故龙不生得。”［15］2323无论是五行的神格化，还是以“龙”为“水物”，均显示此时“五行”已经具有类型化的属性。不过，当蔡墨进而论及“五官”之神的形成过程时，他以五官先后出自少皞、颛顼、共工三氏，且为六人所分守，这种结构上的粗疏显示出此时的“五行说”尚未达到充分系统化的水平，其与“阴阳”似乎也未发生关联。

所有受试者均经MRI检查，然后对其3D-TOF-MRA和3D-FIESTA影像资料进行对比分析。①诊断设备选用型号为Signa HDxt 3.0T超导型MRI成像系统设备（GE公司），其能够高效准确的对三又神经脑池段进行3D-TOF-MRA和3D-FIESTA扫描；②扫描检查出来的最终结果邀请神经科医师和至少两名MR诊断医师共同使用盲法进行读片，然后判断出患侧组及健侧组三叉神经脑池段，分别与周围血管的关系及责任血管构成比[3]。

1.3.2 果蝇羽化率和生长周期的测定

每只果蝇培养管随机放入9～12只羽化3 d的Cg处女蝇,3～5只雄性杂交品系果蝇,25 ℃培养下培养3 d(即交配3 d),然后将它们转移到葡萄汁培养板上产卵24 h。新孵化的1日龄幼虫被转移到果蝇培养基上进行后续培养。密度控制为每管50只幼虫,每组10管,统计羽化果蝇的数目和每管果蝇全部羽化所用时间。羽化率计算公式为:

根据活性氧检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,货号S0033S)的使用说明,使用绿色荧光探针DCFH-DA对活性氧水平进行检测。

羽化率=(羽化的果蝇数/50)×100%。

1.3.3 果蝇寿命的测定

虽然国家在解决贫困人口问题上做出了坚持不懈的努力，也让农村经济得到了极大的发展，但是任务并没有完成。这是当前我国社会矛盾的真实反映，同时这也是我国在全面建成小康社会的道路上必须跨越的一步，需要全社会的共同的努力。

图1中,A组、B组分别表示Piwi-RNAi的2个品系,下同。由图1可知,对照组果蝇羽化率将近100%,而Piwi敲低后果蝇的羽化率明显降低,只有40%～50%。这说明Piwi所调控的某种机制对果蝇的生长发育有至关重要的作用。

对于有单独公猪舍的猪场，应想法使公猪舍的室温保持在13℃～20℃，或者把公猪放入后备舍或妊娠母猪舍以维持公猪需要的适宜温度，减轻降温对公猪的影响。

果蝇培养基的制备。天平准确称取玉米粉100 g、大豆粉10 g、白糖14.5 g、红糖40 g、酵母25 g、琼脂8 g,蒸馏水1 L搅拌均匀并煮沸。冷却至适当温度,加入防腐剂(2%),倒入果蝇培养管,冷却凝固后即可使用。果蝇饲养的温度为25 ℃,湿度为65%。

1.3.5 细胞ROS水平的测定

入组患者均于术前抽取静脉血2mL，采用北京华夏时代基因科技发展有限公司的试剂对CYP2C19*2、CYP2C19*3基因型进行检测。

1.4 数据统计与分析

通过SPSS22.0软件分析处理实验数据,实验结果表示为(平均值±标准差),组间差异使用One-Way ANOVA检验,本实验中显著性水平P<0.05(*),P<0.01(**),P<0.001(***)。

2 结果与分析

2.1 对果蝇羽化率的影响

对外部市场项目开展监督制约是一项专业性较强、涉及面广、情况比较复杂的综合性工作，需要认真总结工作经验，不断向宽领域和深层次延伸，使监督制约工作逐步走上制度化、规范化的道路，以促进社会市场项目优质、廉洁、高效运行，保障企业利益的实现。

1.3.4 细胞甘油三酯水平的测定

图1 敲低脂肪体Piwi对果蝇羽化率的影响

每只果蝇培养管放入20只同一天羽化的雌蝇,每组10管。每2 d转移到新的培养管(保证食物新鲜与充足),除去管底已死亡的个体并统计记录,直到每管不存在存活个体,29 ℃、65%湿度,每组10管。

羽化率是衡量果蝇生存能力的重要指标。在实验过程中发现Piwi敲低后果蝇的羽化率显著下降,统计结果如图1所示。

2.2 对果蝇生长周期和寿命的影响

一般饲养环境下正常果蝇从幼虫到羽化约为10 d,Piwi敲低后果蝇生长迟缓,结果如图2所示。

图2 敲低脂肪体Piwi对果蝇生长周期的影响

Piwi敲低组果蝇生长周期与对照组相比延长,大约比对照组多2 d。

不同组别果蝇的存活率如图3所示。由图3可知,与对照组相比,Piwi敲低后果蝇的寿命发生显著缩短,Piwi-RNAi的2个品系均在40 d左右发生大规模的死亡,分别在60、70 d时全部死亡。实验结果表明,Piwi对果蝇的存活十分重要。

图3 敲低脂肪体Piwi对果蝇寿命的影响

图4 敲低脂肪体Piwi对果蝇TAG的影响

2.3 对果蝇脂肪体功能的影响

甘油三酯(triacylglycerol,TAG)是脂质的重要组分,果蝇的内源性TAG主要分布在脂肪组织中,功能是供给和储存能量[21]。因此甘油三酯含量是鉴定脂肪体功能的重要指标,反映脂肪体的储存代谢[22],结果如图3所示。与对照组相比,Piwi敲低后果蝇脂肪体TAG摩尔分数显著下降,2个品系均降低到50%以下。本实验结果表明,Piwi对脂肪体的功能至关重要,Piwi敲低引起脂肪体TAG的储存异常。

式中，(0,σ2)分别为窃听节点处第1跳和第2跳的复加性高斯白噪声.本文中，符号上标(1)、(2)分别表示第1跳和第2跳.

2.4 果蝇脂肪体细胞的过氧化

为进一步研究脂肪体细胞在Piwi敲低后受到何种影响,本实验通过使用活性氧检测试剂盒来鉴定果蝇脂肪体细胞内的ROS水平,染色结果如图5所示。由图5可知,与对照组相比,Piwi-RNAi的2个品系脂肪体细胞内ROS荧光强度显著增强,说明Piwi敲低后,脂肪体细胞ROS积累过多。ROS堆积会对脂肪体细胞的储存功能造成严重损伤,这是影响果蝇生长发育的重要原因。

图5 敲低果蝇脂肪体Piwi的ROS水平

3 结 论

本文以果蝇为模式生物,研究了Piwi基因在脂肪体表达量降低对果蝇生长发育的危害以及对脂肪体储存功能的干扰。实验结果表明,Piwi敲低导致果蝇脂肪体细胞内产生大量ROS,引起脂肪体储存TAG的功能下调,影响果蝇的生长发育,导致果蝇羽化率下降、发育迟缓以及寿命缩短。本研究发现Piwi在脂肪组织中的重要功能,为后续研究Piwi在脂质代谢中发挥的功能提供参考。