人工老化小粒咖啡种子的红外光谱鉴别

甘玉佳，欧全宏，郑钧文，周湘萍，刘 刚*，时有明

（1.云南师范大学物理与电子信息学院，云南 昆明 650500；2.曲靖师范学院物理与电子工程学院，云南 曲靖 655011）

种子是农业生产的基本生产资料，种子活力是种子质量的重要指标，高活力种子具有更大的生长潜能和优势［1］。种子老化是指种子活力自然衰退，随贮藏时间的延长而发生的复杂生理生化变化［2］。种子老化很大程度上取决于种子贮藏的环境条件，贮藏条件恶劣将加速种子衰老和劣变［3］。传统的种子老化检测方法耗时较长、会对种子造成损伤、需要专业人员操作［4］，因此快速、无损、操作简单的测定方法成为当前种子老化检测发展的重要趋势。红外光谱技术在农作物种子检测中具有简单、快速、灵敏、绿色、成本低及操作简便等优点［5］。刘杰等（2021）［6］利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）对人工加速老化水稻种子进行检测，可以快速、有效区分不同老化程度的水稻种子。Andrade G C 等（2020）［7］利用衰减全反射红外光谱（ATR-FTIR）对2 个玉米杂交品种加速老化过程中生化变化进行识别，并建立评估活力的模型。Czekus B 等（2019）［8］通过傅里叶变换红外光谱技术和拉曼光谱技术研究2 个品种藜麦种子中的有机物差异。田雪等（2022）［9］利用FTIR 法结合曲线拟合和主成分分析对3 种小米及其9 个不同产区进行了鉴别和分类。Fioresi D B等（2021）［10］利用红外光谱对阿拉比卡和罗布斯塔咖啡种子之间的差异进行了研究，证明了两者的红外光谱存在差异。

咖啡是世界上交易最广泛的商品之一，特别是阿拉比卡咖啡豆（俗称小粒咖啡）因其顺滑、温和且醇厚的风味受到消费者的喜爱，占全球咖啡种植面积的70%以上。云南省主要咖啡种植区域为保山市、普洱市、临沧市、德宏傣族景颇族自治州等地。保山市隆阳区于1952年开始大规模种植小粒咖啡，优异的气候条件、适宜的土壤环境及充足的日照，使该地产出的小粒咖啡豆品质极佳，在国际上被称为“中国云南小粒咖啡”，是我国极少数被世界公认的农特产品之一［11］。国内咖啡市场普遍存在咖农盲目种植的现象，严重削弱了咖啡产业的市场竞争力，阻碍了咖啡产业的可持续发展［12］。咖啡种子在常温下最多能储存2～6 个月，之后活力会迅速丧失，影响种子田间健植率和植株生产性能［13］。目前，国内外对咖啡种子的研究更多是对商业咖啡品质评价、咖啡中化学成分检测和不同基因型、品种及产地鉴别等，很少有针对咖啡种子老化测定的研究。

本研究采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）对不同老化程度的小粒咖啡种子进行检测，获得其红外指纹图谱，结合曲线拟合、主成分分析和系统聚类分析对不同老化程度的小粒咖啡种子进行分析，建立小粒咖啡种子快速、无损的老化检测方法，对优质小粒咖啡的农业生产和种质资源保护有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究试验所用材料为小粒种咖啡（Coffea arabicaL.）种子，于2022年3月收获，采自云南省保山市潞江镇新寨村（25°03´N，109°34´E），平均海拔1 300 m。种子含水量约7%（用卤素水分仪测得，仪器为厦门米德电子科技有限公司生产，型号：QL-100B），千粒重为172.62 g。

1.2 方法

1.2.1 人工加速老化

将咖啡果脱壳后，用水洗净表面的胶质体，自然晾晒4 d，挑选颗粒饱满的种子进行处理。参照殷勤等（2016）［13］的方法，对咖啡种子进行人工加速老化，采用杭州绿博仪器有限公司生产的LH-150S种子老化箱，设置老化箱恒定温度为40 ℃，相对湿度为98%。老化时间分别为0、2、4、6、8 d，老化完成后将种子在室温下晾3～4 d，确认种子含水量降至原状态后进行光谱检测。

1.2.2 FTIR测量

将咖啡种子的羊皮纸壳剥掉，同时去除干净生咖啡豆的银皮，用研磨机研磨成粉末，并与适量KBr粉末混合均匀进行压片，以纯溴化钾片为背景，采集咖啡样品的红外光谱。采用的红外光谱仪是Perkins Elmer 公司Frontier 型傅里叶变换红外光谱仪，配有氘代硫酸三甘肽晶体（DTGS）探测器。光谱采集范围为4 000～400 cm-1，16 次扫描，分辨率为4 cm-1，以未老化种子为对照，测20 个样品，其他老化时间的种子各测10 个样品，3 次重复测量取平均值，光谱采集使用Spectrum 10.03 软件。

1.2.3 数据处理

采用OMNIC 8.2 软件对所得原始光谱进行预处理，包括基线校正、13 点平滑、纵坐标归一化和导数谱图等；用Origin 2018 软件进行主成分分析（PCA）和峰值拟合分析，用SPSS 24 软件进行系统聚类分析（HCA）。

建立PCA 模型时，采用1 750～1 500 cm-1范围的红外光谱数据，HCA 模型选取1 800～800 cm-1范围的数据。

2 结果与讨论

2.1 傅里叶变换红外光谱分析

由图1 可以看出，不同老化天数的咖啡种子的原始红外光谱峰整体相似，种子在老化的过程中差异不大。

表1 列出了不同老化天数的咖啡种子的主要吸收峰及归属，可以看出，小粒咖啡红外光谱峰主要由蛋白质、脂质和多糖峰组成。

表1 人工老化小粒咖啡的红外谱峰位置及其归属

图2 为人工老化小粒咖啡种子的傅里叶变换红外光谱峰强比。图2（a）中所有特征峰强度比A2926/A3010、A2855/A3010、A1745/A3010、A1461/A3010、A1380/A3010的值整体随着人工老化时间的增加显示升高趋势，分别由老化前的2.50、1.66、0.93、0.97、1.06 升高到老化8 d 后的3.36、2.04、1.38、1.52、1.66，说明小粒咖啡中脂质的相对含量可能随着老化时间的增加而产生正相关变化。图2（b）中A1118/A3010、A1055/A3010显示出相同的变化趋势，先增强后减弱然后明显增强，分别由未老化时的1.16、1.25 升高到老化8 d 的2.46、2.88；A1646/A3010的特征峰强度随着老化时间先降低后增强，由未老化时的1.57 逐渐降为老化6 d 的1.25，随后老化8 d 升高到2.00，表明蛋白质和多糖在老化的过程中也产生了变化。

图2 人工老化小粒咖啡种子的红外光谱峰强比

2.2 二阶导数红外光谱

图3（a）、图3（b）分别为人工老化小粒咖啡种子在蛋白质和脂肪（1 800～1 600 cm-1范围）、多糖（1 200～950 cm-1范围）特征区域的二阶导数红外光谱，在这2 个区域，人工老化小粒咖啡吸收峰数量随老化天数增加而减少。其中1 800～1 700 cm-1区域的吸收峰主要由脂质中C=O 伸缩振动引起，所有人工老化样品在该区域均出现2 个特征峰，分别在1 745 cm-1和1 711 cm-1附近，其中1 745 cm-1为脂类物质最典型的特征吸收峰。

1 700～1600 cm-1区域主要是蛋白质酰胺Ⅰ带，受C=O 伸缩振动的影响。不同老化小粒咖啡种子吸收峰位置在该区域出现了差异，老化2 d 和4 d的种子在1 696 cm-1附近出现了吸收峰，而只有老化8 d 的小粒咖啡种子在1 642 cm-1附近的峰消失，说明该峰与蛋白质酰胺Ⅰ带有关。其他共有的吸收峰出现在1 658、1 609 cm-1附近，1 700～1 660 cm-1范围内的吸收峰包含β-转角结构，1 660～1 650 cm-1范围内的吸收峰为α-螺旋结构，1 650～1 640 cm-1范围内吸收峰为无序结构，1 640～1 600 cm-1范围内包含β-折叠结构，以上结构均属于蛋白质二阶结构。

1 200～950cm-1区域特征峰主要受归属为多糖和糖苷键C-O 基团、C-O-C 键的伸缩振动、C-H 键和C-OH 键的弯曲振动的影响［22］。该区域人工老化8 d的样品差异明显，老化0、2、4 d 的种子都在多糖区域内出现了1 182、1 159、1 119、1 098、1 079、1 055、1 030、991、959 cm-1附近的9 个峰，老化6 d 的种子缺少1 182 cm-1附近吸收峰，而老化8d 的种子只有1 163、1 114、1 083、1 038、991、958 cm-1这6 个峰。随着老化时间的增加，除老化8 d 外，其他不同老化时间的小粒咖啡种子在1 159、1 098 cm-1附近的吸收峰向高波数位置移动，在1 119、1 030、991、959 cm-1附近的吸收峰向低波数位置移动，这些峰位置发生变化可能与多糖的结构或含量变化有关。

2.3 曲线拟合分析

根据不同老化时间小粒咖啡种子在该区域的二阶导数红外光谱确定出现的吸收峰位置和个数，对其原始红外光谱1 770～1 500 cm-1范围进行曲线拟合，经基线校正后采取高斯分布进行分解，得到的拟合结果R2值均在0.999 以上，每个老化时间下的各种样品光谱均进行了8 次拟合。拟合结果如图4所示，计算出特征峰峰面积百分比的平均值，统计结果见表2 和图5。

表2 人工老化小粒咖啡种子在1 770～1 500 cm-1范围内曲线拟合子峰的面积百分比

图4 人工老化小粒咖啡种子红外光谱在1 770～1 500 cm-1范围的曲线拟合光谱

图5 为不同老化时间下小粒咖啡种子脂质特征峰（1 740 cm-1）、蛋白质特征峰（1 648、1 586 cm-1）和咖啡因特征峰（1 608 cm-1）的峰面积百分比。结果显示，老化0 d 的小粒咖啡种子1 740 cm-1处特征峰的面积百分比为5.22%，老化2～6 d 逐渐增加到14.58%，老化8 d 又减少到6.95%。从图5 中子峰面积百分比的变化可以看出，蛋白质含量最高，1 648 cm-1处的特征峰峰面积百分比在老化0 d时为47.83%，老化6 d 后逐渐减小到28.38%，随后急剧增加到56.48%。1 586 cm-1处的峰面积百分比在老化0 d 时为7.92%，老化6 d 后降低到1.21%，老化8 d 后增加到9.41%，2 个蛋白质特征峰随老化时间的峰面积变化趋势一致，该趋势与原始光谱中蛋白质特征峰峰强比变化趋势一致，而且蛋白质含量最高，说明蛋白质是小粒咖啡种子的重要组成成分。1 608 cm-1处峰面积百分比从老化0 d的6.75%增加到老化4 d 的18.69%，老化6～8 d减小到3.18%。

2.4 主成分分析

为了分析数据中隐含的结构信息，了解不同老化时间对小粒咖啡种子引起的差异，选用20 个未老化小粒咖啡种子和其他老化处理后各10 个样本光谱，对不同老化程度的小粒咖啡种子在1 750～1 500 cm-1区域的傅里叶变换红外光谱进行主成分分析。

由图6 可知，前2 个主成分累计贡献率达99.3%，其中PC1 占总贡献率的93.9%，PC2 占总贡献率的5.4%，这代表了前2 个主成分可以有效区分不同老化程度的小粒咖啡种子。根据图中的分类情况可以看出，不同老化时间处理下的小粒咖啡种子显示出了清晰的聚类，每个时间的样品都准确分为一类，老化8 d 的种子与未老化种子最接近，老化6 d的样品与未老化样品离得最远。

图7（a）、（b）分别为PC1 和PC2 的载荷图。PC载荷图表示不同变量的相关权重，显示了一些对分类具有高度相关性和贡献度的特征峰。在PC1 载荷图中，1 750～1 500 cm-1范围出现的峰都为正峰，在1 684、1 548 cm-1左右出现较强的峰，说明这些峰与PC1 具有正相关性。在PC2 载荷图中，1 750～1 684 cm-1和1 545～1 500 cm-1范围内出现正峰，说明这些峰与PC2 具有正相关性，1 684～1 545 cm-1范围内为负峰，该区域的吸收峰与PC2 有负相关关系，其中最强峰出现在1 589 cm-1附近。

以上结果表明，不同老化时间下的小粒咖啡种子间存在差异，2 个主成分中较强的峰都归属于蛋白质吸收峰，由此推断，小粒咖啡中蛋白质含量的差异是主成分判别中的主要依据，在PC1 和PC2 的不同程度老化分类中承担主要贡献，印证了曲线拟合中蛋白质是小粒咖啡中重要组成成分的结果。

2.5 系统聚类分析

图8 为人工老化小粒咖啡种子在1 800～800 cm-1范围内红外光谱的系统聚类分析结果。用SPSS 24对人工老化小粒咖啡种子样品（未老化以及老化2、4、6、8 d 各取5 个，共25 个光谱样本）在1 800～800 cm-1范围内进行聚类分析，聚类方法为组间连接，区间选择欧氏距离。未老化小粒咖啡种子聚为一类且与其他样品的相距最远，距离为25，老化4 d小粒咖啡种子单独聚为一类；老化2、6、8 d 小粒咖啡种子各自聚为一类，并聚集在一起；老化2 d 和老化6 d 小粒咖啡种子距离最近，说明这两种样品在成分或物质含量上最相似。系统聚类分析和主成分分析均能对不同老化时间小粒咖啡种子进行较好的分类，表明多元统计分析可以用来分析人工老化小粒咖啡种子。

图8 人工老化小粒咖啡种子红外光谱的系统聚类分析

3 结论

本研究利用傅里叶变换红外光谱法、二阶导数红外光谱、曲线拟合分析结合多元统计学方法对人工老化小粒咖啡种子进行分析。光谱结果显示，人工老化小粒咖啡种子的红外光谱主要物质的吸收峰整体相似。根据红外光谱的吸收峰强度可得，随着老化时间的增加，脂类物质特征峰峰强比明显增加，糖类物质特征峰峰强比表现为先增后减再增，而蛋白质特征峰峰强比变化趋势为先减小后增加。二阶导数红外光谱显示，人工老化小粒咖啡种子在1 800～1 600 cm-1和1 200～950 cm-1范围内的峰数量随着老化时间的增加而减少，部分吸收峰随老化时间发生峰移。曲线拟合在1 770～1 500 cm-1范围内进行分析，不同老化时间的小粒咖啡种子的子峰位置和面积百分比存在差异，人工老化小粒咖啡种子中脂质和咖啡因所对应峰的相对含量呈现先增后减趋势，蛋白质所对应峰的相对含量呈现先减后增趋势，且面积百分比最大。多元统计方法显示，在1 750～1 500 cm-1范围内的主成分分析和在1 800～800 cm-1范围内的系统聚类分析均能实现5 个不同老化时间的小粒咖啡种子独立聚类。主成分分析载荷图显示，对不同老化小粒咖啡种子分类贡献最大的吸收峰归属于蛋白质，证明了老化过程中蛋白质是主要的变化物质之一。系统聚类分析不仅可以根据其结果得到不同样品之间的接近程度，且分类效果比主成分分析更好。结果表明，红外光谱法结合多元统计分析可以快速、有效地区分不同老化程度的小粒咖啡种子。