羌药胃草质量评价研究

谭承佳,田 徽,黄御莲,李玉莲,刘容西,马晓燕

(1.绵阳师范学院生命科学与技术学院,四川绵阳 621000;2.绵阳市中药质量控制与评价重点实验室,四川绵阳 621006;3.北川羌族自治县中羌医医院,四川北川 622750)

0 引言

羌药胃草为豆科山蚂蝗属植物小槐花(Desmodiumcaudatum(Thunb.) DC.)的干燥全株[1],作为羌族药、苗族药、瑶族药、壮族药,收录于《民族药志》中[2].甘、苦、微寒,归心、肺和脾经,具有清热解毒,祛风通疹,消散止痛的功效.内服多用于感冒发烧,肠胃炎,痢疾,小儿疳积,风湿关节痛;外用治疗毒蛇咬伤,痈疖疔疮,乳腺炎等疾病的治疗[3-5].胃草中主要含有黄酮类、生物碱类、萜类及多酚类及挥发油类等多种化合物[6-10].目前2010年版《四川省中药材标准》收载小槐花质量标准[1],规定性状、显微鉴别、检查(水分、总灰分、酸不溶性灰分)、浸出物,活性成分提及主要含黄酮类成分,未做定性鉴别及含量测定规定,不能全面反映药材内在质量,故本实验在原有质量标准的基础上,选择牡荆素、异牡荆素、芦丁为指标,采用TLC、HPLC、UV-可见分光光度法对胃草进行定鉴别和黄酮类成分含量测定,以期为完善羌药胃草的质量标准提供依据.

1 材料

1.1 仪器

安捷伦AgiLent 1100分析型高效液相色谱仪(美国安捷伦)、洁盟JP-060型超声波清洗机(深圳洁盟清洗设备有限公司)、AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)、超纯水机(美国millipore).

1.2 试剂与药物

牡荆素(批号MUST-20091710)、异牡荆素(批号MUST-20070110)对照品(成都曼思特生物科技有限公司);聚酰胺薄层(青岛).甲醇、乙腈、甲酸、三乙胺磷酸溶液为色谱纯(美国fisher公司);水为超纯水;其他试剂均为分析纯(四川科隆试剂).

1.3 药材

胃草共6批(表1),由绵阳师范学院田徽教授鉴定为豆科山蚂蝗属植物小槐花(Desmodiumcaudatum(Thunb.)DC.)的干燥植株.

2 方法与结果

2.1 性状鉴定

羌药胃草的根呈圆柱形,长5～15 mm,带有支根,表面呈现出灰褐色或棕褐色,具细纵皱纹,有疣状突起和长圆形的皮孔.质坚韧不易折断,横截面为黄白色且有纤维性.圆柱形的茎,常有分枝,表面为灰棕色,皮孔呈圆形,质硬而脆.叶呈三出复叶互生,小叶大多会皱缩脱落,展平后呈披针形,顶端渐尖或锐尖,茎部楔形,全缘.气微,味淡[1,3].

2.2 粉末显微鉴别

胃草药材粉末经水合氯醛试液加热,透化,滴加稀甘油装片,置显微镜下观察,粉末呈米黄色,淀粉粒极多,单粒淀粉粒类球形或椭圆形,直径8.4～15 μm,脐点裂缝状或人字状,层纹不明显;复粒淀粉粒由2～4粒组成,脐点和层纹都不明显.方晶较多,单个散在,呈棱形、方形或多面形.晶鞘纤维较多,单个散在.纤维少见,长1.1～1.5 mm,端尖长.孔纹导管较多,可见螺纹、梯纹导管.非腺毛较多,长2.6～3.4 mm,表面有疣状突起,壁厚[1].见图1.

注:1～6分别为非腺毛、方晶、淀粉粒、梯纹导管、木纤维、晶鞘纤维(10×40)图1 胃草粉末显微特征Fig.1 Microscopic characters of Desmodi- umcaudatum DC.

2.3 牡荆素、异牡荆素的薄层鉴别

取胃草粗粉约4 g,精密称定,置于圆底烧瓶中,加60%乙醇溶液100 mL,加热回流1 h,放冷,滤过,回收乙醇至40 mL,加水10 mL,搅匀,石油醚萃取至无色,乙酸乙酯振摇提取2次,每次25 mL,合并乙酸乙酯液,减压浓缩至干,甲醇溶解定容至5 mL,即得.另精密称取牡荆素、异牡荆素对照品适量,分别置两个容量瓶中,各加甲醇制成含牡荆素、异牡荆素0.5 mg/mL的对照品溶液.分别吸取供试品、牡荆素、异牡荆素对照品溶液各20 μL,点样于同一聚酰胺薄层,以乙酰丙酮-95%乙醇-水(2∶2∶3)为展开剂,展开,取出,晾干,喷20 mg/mL的三氯化铝乙醇溶液,105 ℃加热5 min后,置紫外光(365 nm)下检视.供试品在与对照品色谱相应的位置上,显相同的亮蓝色斑点,并测得牡荆素Rf=0.69,异牡荆素Rf=0.73,展开斑点圆整,不拖尾,供试品与标准品对应点清晰,展开效果较好.见图2.

注:S为供试品CW-1;1、2为牡荆素、异牡荆素对照品图2 牡荆素、异牡荆素TLC色谱图Fig.2 TLC Chromatography of vitexin; isovitexin

2.4 水分、总灰分、酸不溶性灰分、乙醇浸出物含量测定

照《中国药典》2020年版通则项下,对水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物进行检查,结果见表2.

2.5 含量测定

2.5.1 牡荆素的HPLC含量测定[11-13]

(1)液相色谱条件.色谱柱:Diamonsil-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-0.5%甲酸(7∶93);检测波长360 nm;流速1.0 mL/min;柱温30℃.色谱图见图3.理论塔板数按牡荆素计,不低于3 000.

图3 牡荆素HPLC图Fig.3 HPLC chromatograms of vitexin

(2)溶液制备.①对照品溶液制备:精密称取牡荆素对照品适量,加50%乙腈溶解制成0.101 mg/mL的溶液,经0.22 μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得.②供试品溶液制备:取胃草粗粉5 g,精密称定,置于圆底烧瓶,精密加入80%甲醇50 mL,称定重量,至80 ℃水浴加热回流1.5 h,取出放冷,加80%甲醇补重,摇匀,滤过,滤液经0.22 μm微孔滤膜过滤,即得.

(3)含量测定方法学考察.①线性范围考察:分别精密吸取“2.5.1(2)”溶液制备项下对照品溶液1、2、3、4、5 μL进样,照“2.5.1(1)”项下色谱条件进样测定峰面积,以峰面积(Y)对进样量(X)进行回归,得牡荆素方程为y=3 307.4x-31.51(r=0.999 9),牡荆素在0.101～0.505 μg范围内,线性关系良好.②精密度考察:精密吸取“2.5.1(2)”溶液制备项下对照品溶液10 μL,照“2.5.1(1)”色谱条件项下进样测定6次,测得牡荆素峰面积RSD值为1.84%,结果表明仪器精密度良好.③稳定性考察:精密吸取“2.5.1(2)”溶液制备项下供试品溶液10 μL,分别于0、4、8、12、24 h照“2.5.1(1)”项下色谱条件进样测定峰面积,测得牡荆素峰面积RSD值为1.88%,表明溶液放置24 h稳定.④重复性考察:取同一批胃草粗粉(WC-1)6份,照“2.5.1(2)”溶液制备项下方法制备供试品溶液,照“2.5.1(1)”项下色谱条件进样测定峰面积.计算牡荆素含量为0.104 3 mg/g,RSD值为1.36%,重复性试验结果良好.⑤加样回收率考察:取胃草(WC-1)粗粉6份,每份约2.5 g,精密称定,分别加入牡荆素对照品溶液(0.258 8 mg/mL)1 mL,照“2.5.1(2)”溶液制备项下方法制备供试品溶液,照“2.5.1(1)”项下色谱条件进样测定峰面积.计算回收率.结果见表3.

表3 牡荆素加样回收率试验结果Tab.3 Results of recovery tests for vitexin

(4)含量测定.取6批胃草药材,照“2.5.1(2)”溶液制备项下方法制备供试品溶液,照“2.5.1(1)”项下色谱条件进样10 μL,测定峰面积,计算含量.结果表明,WC-1～6号药材中牡荆素含量分别为0.113 0、0.116 3、0.115 9、0.113 9、0.116 1、0.114 0 mg/g,平均含量0.114 9 mg/g.

2.5.2 总黄酮含量测定

(1)显色方法.精密量取“2.5.2(2)”溶液制备项下样品溶液适量,置于25 mL的容量瓶中,加60%的乙醇稀释至12.5 mL,加0.7 mL5%的亚硝酸钠溶液,摇匀,放置5 min,加10%的硝酸铝溶液0.7 mL,摇匀,放置6 min,再加1.0 moL/L的氢氧化钠溶液5 mL,混匀,用60%的乙醇溶液定容至刻度,放置10 min后,以相应试剂为空白,照《中国药典》2020年版四部(通则0401)紫外-可见分光光度法,在510 nm处测定吸光度值.

(2)溶液制备.①对照品溶液制备:精密称取芦丁对照品适量,加甲醇制成0.15 mg/mL的对照品溶液.②供试品溶液制备:取胃草药材粗粉约2 g,精密称定,置于圆底烧瓶中,加60%乙醇200 mL,称重,回流提取60 min,放冷,补重,滤过,取续滤液,即得.

(3)含量测定方法学考察.①线性范围考察:分别精密移取“2.5.2(1)”溶液制备项下对照品溶液1、2、3、4、5 mL,照“2.5.2(1)”项下方法显色,测定吸光度,以吸光度(Y)对芦丁对照品浓度(X)进行回归,得芦丁方程为y=25.333x+0.066(r=0.999 2),芦丁在0.006～0.03 mg/mL范围内,线性关系良好.②精密度考察:精密量取“2.5.2(2)”溶液制备项下对照品溶液3 mL,照“2.5.2(1)”项下方法显色,测定6次,计算吸光度RSD值为0.24%,表明仪器精密度良好.③稳定性考察:精密量取“2.5.2(2)”溶液制备项下同一供试品溶液3 mL,于0、0.5、2、1.5、2、3 h照“2.5.2(1)”项下方法显色,测定,吸光度RSD值为0.5%,表明溶液显色后在3 h内稳定.④重复性考察:取胃草粗粉(WC-1)6份,照“2.5.2(2)”溶液制备项下方法制备供试品溶液,精密量取3 mL,照“2.5.2(1)”项下方法显色,测定吸光度,计算总黄酮含量为2.031 9 mg/g,RSD值为1.14%(n=6),表明重复性良好.⑤加样回收率考察:取胃草(WC-1)粗粉6份,各约1 g,精密称定,分别精密加入芦丁对照品溶液(1.5 mg/mL)1.4 mL,照“2.5.2(2)”溶液制备项下方法制备供试品溶液,照“2.5.2(1)”项下方法显色,测定吸光度,计算回收率.结果表明总黄酮平均加样回收率(以芦丁计)为97.2%,RSD值为1.26%(n=6).

(4)总黄酮含量测定.取6批胃草药材粗粉,照“2.5.2(2)”溶液制备项下方法制备供试品溶液,照“2.5.2(1)”项下方法显色,测定吸光度,计算含量.结果表明,胃草药材(WC-1～6号)中总黄酮含量(以芦丁计)分别为2.062 3、2.069 2、2.079 8、2.059 0、2.048 4、2.065 9 mg/g,平均含量2.064 1 mg/g.

3 讨论

3.1 TLC定性鉴别

本实验选择胃草中的黄酮类化合物牡荆素、异牡荆素作为指标成分,以聚酰胺薄膜为固定相,进行温度、相对湿度、展开剂等系统耐用性实验,实验比较了正丁醇-水-醋酸(4∶1∶1)、甲酸-乙酸乙酯-水(1∶8∶1)、乙酰丙酮-95%乙醇-水(2∶2∶3)三种展开剂的展开效果,结果发现,使用正丁醇-水-醋酸(4∶1∶1)、甲酸-乙酸乙酯-水(1∶8∶1)系统展开后,牡荆素和异牡荆素分离度较小且有拖尾;使用乙酰丙酮-95%乙醇-水(2∶2∶3)系统展开,背景干扰较小,展开斑点圆整,分离度良好.

3.2 检查项限量

6批胃草药材中,水分、总灰分、酸不溶性灰分分别为1.50%～1.83%、4.63%～4.80%、1.16%～1.21%,结合平均值,参照四川中药材质量标准[1],暂定水分、酸不溶性、总灰分灰分分别不得超过13.0%、2.0%、8.0%.

3.3 浸出物限量

6批胃草药材中,水溶性浸出物含量为15.64%～16.58%,参照四川中药材标准收载小槐花标准[1],暂定不得低于10.0%.

3.4 黄酮类成分含量测定

牡荆素、异牡荆素为胃草中黄酮类成分,具有抗心肌缺血、抗炎、降血糖、抗肿瘤等药理作用[4-5].本实验选择牡荆素、异牡荆素作为指标成分,采用HPLC测定牡荆素含量在0.113 0～0.116 3 mg/g,平均含量为0.114 9 mg/g.采用UV-Vis法测定胃草中总黄酮含量为在2.048 4～2.079 8 mg/g,平均含量为2.064 1 mg/g.以不合格率低于样本量的20%设限,暂定胃草中牡荆素含量不得低于0.09 mg/g,总黄酮含量不得低于1.6 mg/g.

4 结论

本实验测定了胃草药材中的水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量,并参照《四川省中药材标准》规定了限量.同时实验建立了胃草药材中的牡荆素、异牡荆素TLC定性鉴别方法;牡荆素的HPLC含量测定方法;总黄酮的UV-Vis含量测定方法.所建立的方法简便、科学、准确,可为完善羌药胃草的质量标准、开发利用药材资源提供依据.