西格列汀通过上调TTF-1/SP-B通路对LPS诱导小鼠急性肺损伤的保护作用

王小川，杜发旺，姚 宇，李 丽，何高燕，王汉超，王 勤，熊 伟，朱 涛，3

1.遂宁市中心医院呼吸与危重症医学科（遂宁 629000）；2.重庆医科大学附属第二医院呼吸与危重症医学科（重庆 400010）；3.遂宁市中心医院基础实验室（遂宁 629000）

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是最常见的非心源性急性肺水肿，临床上主要表现为呼吸窘迫与顽固性低氧血症[1-2]。急性肺损伤（acute lung injury，ALI）和ARDS 是同一个疾病连续的两个不同阶段[3-5]。目前研究表明肺表面活性物质（pulmonary surfactant，PS）减少、肺顺应性下降和通气/血流失调是ALI/ARDS 最主要的病理生理特征[5-6]。PS是一种主要由Ⅱ型肺泡上皮细胞（type Ⅱalveolar epithelial cell，AEC Ⅱ）合成和分泌的大分子聚合物，其主要的生物学作用包括维持肺泡顺应性、肺泡内外液体平衡、调控肺组织固有免疫等[7-8]。研究发现促进PS 的蛋白成分（如SP-A 和SP-B 等）表达或外源性给予PS 可有效改善ARDS 患者的氧合水平，促进肺水肿液的吸收[9-10]。我们前期研究证实在小鼠ALI 模型中，胰高血糖素肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）的拟似物利拉鲁肽（liraglutide）可通过上调甲状腺转录因子-1（thyroid transcription factor，TTF-1）信号通路改善肺损伤，减轻肺组织炎症[11]。同时，研究证实在肠道细胞中二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4；又称CD26）是GLP-1代谢的关键酶。DPP4抑制剂（如西格列汀和沙格列汀等）可有效降低DPP4 活性，从而抑制GLP-1 的分解，增加组织中GLP-1 浓度和存留时间[12-13]。因此，本研究的目的是探讨DPP4抑制剂西格列汀对小鼠ALI的保护作用以及潜在的分子机制和信号通路，为临床治疗ARDS提供新线索和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 主要材料

实验动物SPF级雄性BALB/C小鼠，由四川大学实验动物中心提供。DPP4 抑制剂西格列汀购于美国默沙东制药公司（捷诺维，国药准字J20140095）。内毒素（LPS）购于美国Sigma公司。聚合酶链反应（PCR）引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。总RNA 抽提试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。第一链cDNA 合成试剂盒和PCR 试剂盒购于Takara 公司。小鼠TTF-1 抗体、SP-B 抗体和β-actin 抗体购于美国Santa Cruz公司。

1.2 小鼠模型的建立

按照随机数字表法将32只雄性BALB/C 小鼠分为对照组、DPP4抑制剂西格列汀组（DPP4I组）、内毒素组（LPS组）和LPS+DPP4I组，每组8只。根据我们的前期研究方案，LPS 组和LPS+DPP4I 组小鼠通过气道内注射LPS（10µg LPS 溶于50µL 生理盐水）诱导建立ALI模型[14-15]。LPS 干预72 h 后处死小鼠获取标本。干预开始7 d前，灌喂DPP4I组和LPS+DPP4I组小鼠西格列汀（100 mg/kg，1 次/d），直到处死小鼠获取标本，共10次[16-17]。对照组给予生理盐水代替LPS。动物实验方案经遂宁市中心医院动物伦理委员会审核批准。

1.3 HE染色观察病理变化并进行肺损伤评分

取左肺下叶，根据我们前期研究，采用HE 染色观察肺组织病理改变[18]，对肺损伤程度进行评分[3-4，11]。

1.4 肺泡灌洗液炎症细胞分类计数

根据前期研究方案，收集小鼠肺泡灌洗液（BALF），采用Diff-Quik 染色，使用血细胞计数器（hemocytometer）对BALF的细胞总数、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞进行计数[19-20]。

1.5 肺组织湿/干比测定

根据前期研究方案，小鼠处死后取出肺组织，将小鼠右中肺置于80 ℃烤箱24 h至恒重后，记录前后肺组织重量，计算肺组织湿/干比（W/D）值[3，11]。

1.6 qPCR法检测TTF-1、SP-B表达

取右肺上叶组织，按照试剂盒说明书提取总RNA。以总RNA为模板，用Oligo（dT）18作为引物，按照试剂盒说明书介绍要求合成cDNA第1链。TTF-1：正义5'-AACAGC GGCCATGCAG CAGCAC-3'，反义5'-CCATG TTCTTGC TCACGTCC-3'；SP-B：正义5'-CCAAGTGCT TGATGTCTACC-3'，反义5'-CTGGATTCTGTTCTGGCT TA-3'；β-actin引物：正义：5'-GATTA CTGCTCTGGCT CCTAGC-3'，反义：5'-ACTCAT CGTACTCC TGC TTGC T-3'。使用β-actin 作为内参基因，采用2-△△CT公式计算目标基因肺组织TTF-1 和SP-B 的相对表达量，ΔΔCt=（Cttarget-Ctβ-actin）干预组-（Cttarget-Ctβ-actin）对照组[20-21]。

1.7 Western blotting法检测肺组织蛋白表达

按照试剂盒操作要求，首先提取右肺下叶组织总蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后转移至硝酸纤维素滤膜上，用脱脂奶粉封闭1 h，放入兔抗鼠单克隆抗体磷酸化TTF-1（1∶800）和β-actin（1∶2 000）稀释溶液中4℃孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000），用ECL进行显色，用凝胶成像分析系统进行扫描。

1.8 统计学方法

计量资料以均数±标准差描述。采用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析，两样本均数多重比较采用SNK法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织损伤水平

对照组与DPP4I 组小鼠肺组织未见明显病理变化。LPS组：肺泡间隔明显增宽、肺泡内大量炎症细胞浸润和水肿液聚集，并见较多红细胞，肺泡中有透明膜形成。LPS+DPP4I组：肺泡间隔增宽、肺泡内炎症细胞浸润和水肿液聚集程度均较LPS 组更轻，肺泡内见少量透明膜形成。与LPS 组相比较，LPS+DPP4I 组的肺损伤评分更低，差异有统计学意义（P <0.05），见图1和图2。

图1 肺组织HE染色（×200）Figure 1 HE staining of lung tissue（×200）

图2 肺损伤评分Figure 2 Lung injury scores

2.2 BALF中炎症细胞水平

LPS 干预72 h 后，小鼠BALF 中细胞总数、中性粒细胞数、巨噬细胞数和淋巴细胞数均显著升高（P <0.05）。与LPS组相比，LPS+DPP4I组小鼠BALF中各种炎症细胞数均明显更低，差异有统计学意义（P <0.05），见图3。

图3 BALF中炎症细胞Figure 3 Inflammatory cells in BALF

2.3 肺组织W/D比值

W/D 比值是评估小鼠ALI 模型肺水肿严重程度的常用指标[3，11]。LPS干预72 h后，小鼠肺组织W/D比值显著增加（P<0.05）。与LPS 组相比，LPS+DPP4I 组小鼠肺组织W/D比值明显降低（P<0.05），见图4。

2.4 肺组织TTF-1和SP-B的表达水平

与对照组相比，LPS 干预后小鼠肺组织TTF-1 和SP-B mRNA 和蛋白表达水平均明显下降（P <0.05）。与LPS组相比，LPS+DPP4I组小鼠肺组织TTF-1和SPB更高（P<0.05），见图5和图6。

图5 肺组织TTF-1和SP-B mRNA和蛋白表达水平Figure 5 The mRNA and protein expression of TTF-1 and SP-B in the lung tissue

图6 肺组织TTF-1与SP-B的western blotting结果Figure 6 The western blotting results of TTF-1 and SP-B

3 讨论

ARDS 一直是呼吸与危重症医学研究的重点及难点，目前研究显示其死亡率高达30%～70%[1]，主要的病理生理特征包括肺容积减少、肺泡塌陷、肺组织顺应性下降、高通透性肺水肿、氧合功能障碍和肺循环障碍等，临床以呼吸窘迫、顽固性低氧血症和非心源性肺水肿为主要表现[3，14，22]。

GLP-1 是肠道内分泌细胞L 细胞（L cells）和K 细胞（K cells）分泌的一种脑肠肽，是重要的胰岛素促分泌剂，GLP-1对于糖脂代谢具有关键调控作用，生理状态下高脂肪和高碳水化合物食物是促进GLP-1合成与分泌的主要调节因素[23-25]。二肽基肽酶4（DPP4）（即CD26）是一种抗原酶，在多个器官的细胞表面以II型跨膜蛋白的形式表达，是GLP-1代谢的关键酶[26]。因此，DPP4 抑制剂可延长肠促胰岛素激素如GLP-1 和胃抑制多肽等的生物活性，从而改善机体的葡萄糖耐量[26]。目前GLP-1 拟似物与DPP4 抑制剂均已被广泛用于II型糖尿病的治疗。我们前期研究发现GLP-1拟似物利拉鲁肽可有效减轻LPS 诱导的小鼠ALI 模型肺组织炎症反应及肺水肿水平[11]。同时，多个研究表明DPP4抑制剂对于多种因素导致的肺部炎症反应具有调控作用[16，27]。KONG等[16]研究发现DPP4抑制剂西格列汀可以有效减轻重症胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）诱导的ALI 模型小鼠的肺组织损伤、肺水肿和氧化应激水平。ZHANG 等[27]研究显示高选择性DPP4抑制剂阿拉格列汀（anagliptin）对于LPS 诱导的人肺微血管内皮细胞（human pulmonary microvascular endothelial cell，HPMVEC）炎症反应和氧化应激损伤有显著的保护作用。在本研究中，我们发现与LPS 组相比，LPS+DPP4I组小鼠的肺组织病理改变程度、肺损伤评分、肺水肿程度指标W/D 比值及BALF 中各炎症细胞水平均明显更低。该结果表明西格列汀可以有效缓解LPS 诱导的ALI小鼠模型肺损伤和肺水肿程度及炎症反应水平。

PS成分主要包括磷脂和蛋白两部分，其中SP-A和SP-B 是PS 最主要的蛋白组分[11，28]。PS 具有降低气液界面的表面张力维持肺泡顺应性、调控肺内液体平衡和肺组织固有免疫反应等生理学作用[11，28]。研究显示ARDS 患者的肺组织和血中SP-A 和SP-B 水平均明显降低，其水平与ARDS的严重程度呈负相关[29-30]。YANG等[29]的研究发现ARDS 患者血清中SP-A 和SP-B 水平较健康体检者明显下降，同时ARDS关键炎症因子IL-8 的水平与SP-A 和SP-B 水平呈显著负相关。我们前期研究发现在ARDS 存活组患者的氧合指数与BALF中SP-A 水平均较死亡组明显更高[30]。进一步进行相关性分析后发现两者之间的决定系数（R2）为0.531，因此BALF中SP-A水平与ARDS严重程度具有显著正相关性，该指标是ARDS 严重程度的潜在标志物。外源性给予包含SP-B的肺表面活性物质对ALI/ARDS肺损伤具有保护作用。BEZERRA 等[31]研究证明包含SP-B和SP-C的外源性PS药物CUROSURF 可有效缓解高浓度氧诱导的ALI 小鼠模型肺组织损伤、炎症及氧化应激水平，提示CUROSURF 对于ARDS 具有良好的治疗前景。在本研究中我们也发现LPS 诱导的ALI 肺组织SP-B 明显降低，但西格列汀可有效改善LPS 诱导ALI小鼠肺组织中SP-B的下降。

TTF-1属于NKX2同源结构域转录因子家族，是调控肺组织发育、分化及肺表面活性物质合成的关键转录因子[11]。TTF-1 敲除小鼠由于肺组织、甲状腺和脑组织发育严重障碍在出生后迅速死亡[32]。研究显示SP-A和SP-B基因转录区存在TTF-1结合序列，TTF-1对于SP-A 和SP-B 的合成与分泌具有关键调控作用[33]。我们前期通过动物和细胞模型试验证实GLP-1拟似物利拉鲁肽主要是通过上调AEC II细胞TTF-1信号通路促进SP-A的分泌与合成减轻了ALI肺损伤、肺水肿及炎症反应[11]。基于此，我们在本研究中发现DPP4抑制剂西格列汀亦可有效上调LPS诱导的ALI模型小鼠肺组织TTF-1 mRNA 和蛋白的表达水平。因此，我们推测西格列汀对于LPS诱导ALI小鼠肺组织的保护作用可能主要是通过上调TTF-1 促进SP-B 合成实现的。

4 结论与展望

本实验结果发现，在LPS 诱导的小鼠ALI 模型中DPP4 抑制剂西格列汀可以通过上调肺组织TTF-1 表达，促进SP-B合成，有效减轻肺损伤、炎症反应和肺水肿。下一步我们将在体外研究中继续探讨DPP4 抑制剂对于ARDS 状态下II 型肺泡上皮细胞的保护作用及潜在的分子机制。该系列研究有望为DPP4 抑制剂及GLP-1拟似物应用于ARDS临床治疗提供理论依据，并为后续的临床研究奠定基础。