组蛋白去甲基化酶KDM6A在口腔鳞状细胞癌中的作用机制研究

潘乐 赵刚 王丹 金轶男 汪建国 刘苗

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC )由口腔黏膜上皮发展而来,通常与接触烟草致癌物、过量饮酒及感染人乳头瘤病毒相关[1-2]。OSCC通常诊断较晚且侵袭性强,5年生存率仅50%左右[3-4]。证据表明,遗传和表观遗传改变的广泛积累促进了肿瘤的发生[5],在口腔癌中经常观察到组蛋白的翻译后修饰[6]。组蛋白去甲基化酶KDM6A可以通过羟基化反应移除两种形式的甲基化修饰,通过激活此酶的活性可以调控组蛋白甲基化的异常,从而达到抑制相关疾病的目的[7-9]。KDM6A目前被证实可以参与多种肿瘤的发生和迁移,但其在OSCC中的作用知之甚少。本实验通过生物信息学分析和生物学功能研究,初步探究KDM6A调控OSCC的可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

DMEM高糖(11965092)、青霉素-链霉素-新霉素(PSN)抗生素混合物(156400557)、胰酶酚红 EDTA(25200056)(Gibco,美国);RNAIMAX转染试剂(13778150)、PageRuler Prestain Protein Ladder(26616,Thermo,美国)、 transwell小室24 孔8 μm(3422,康宁,美国);口腔鳞状细胞癌细胞系CAL-27(人舌鳞癌细胞,procell,武汉普诺赛生命科技有限公司);Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒,C0037,上海碧云天生物技术有限公司);Fetal Bovine Serum.qualified.(10099141C,BI,以色列);引物[YW,生工生物工程(上海)股份有限公司];吉玛小干扰RNA(JMXGR,上海吉玛制药技术有限公司);Anti-UTX/KDM6A Antibody(A01286-2,武汉博士德生物工程有限公司);HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR (R333-01,南京诺唯赞生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析

1.2.1.1 TCGA 数据库分析 首先登陆http://xena.ucsc.edu/下载口腔鳞癌相关数据,根据患者的mRNA表达量与临床病理参数结合,进行统计学分析。

1.2.1.2 Oncomine数据库分析 本研究重点利用oncomine中查看基因在所有癌症中的差异表达情况模块来进行分析,检索出 KDM6A、KDM6B及UTY基因在口腔鳞状细胞癌及正常口腔组织中的mRNA 差异表达水平。

1.2.2 细胞实验

1.2.2.1 KDM6A转染及鉴定 当细胞密度长到90%左右进行消化、计数、铺板培养,待其密度达70%左右进行转染。包括以下4 组:NC阴性对照组、SiKDM6A敲低组、Vector空载对照组以及KDM6A过表达组。转染完成放回培养箱中继续培养48 h 后,提取蛋白和RNA检测转染效率或进行下一步实验。

1.2.2.2 CCK8和EDU增殖实验 将Vector空载对照组及KDM6A过表达组的细胞以每孔4×105个铺在12 孔板中,放入培养箱中培养,在24 h、 36 h、 48 h 3 个时间点加入CCK8液,检测A值。按照EDU-555细胞增殖检测试剂盒说明书进行EDU增殖实验。

1.2.2.3 细胞迁移实验 划痕修复实验将转染完成的细胞均按5×106个接种到6 孔板中,待汇合度达到80%以上,进行划线,PBS 清洗细胞3～5 次,加入含有1%血清的培养基,拍照记录0 h细胞愈合情况,每隔12 h 观察细胞的愈合程度。Transwell迁移实验将已转染的细胞消化离心后,用不含血清的DMEM培养基重悬细胞,细胞计数并计算密度,稀释至1×105个/mL。在24 孔板底部加入600 μL含20%FBS的培养基,将Transwell小室置于培养基之上,每孔接种500 μL细胞悬液,培养36～48 h后进行固定、结晶紫染色,拍照并分析细胞的迁移情况。

1.2.3 免疫组织化学染色 本实验所用的组织芯片,含口腔鳞状细胞癌组织39 例,口腔正常组织19 例。IHC实验评判标准:对芯片上逐点染色结果进行定位后根据细胞显色强度判为:不着色为阴性(-)、着浅棕色为弱阳性(+),着棕色为阳性(++),着棕褐色为强阳性(+++);依照阳性细胞数量可分为:(-)指阳性细胞小于10%,(+)指阳性细胞数在10%～25%,(++)指阳性细胞数在26%～49%之间,(+++)指阳性细胞数在50%以上。最后根据两者的结果进行综合评判得出定性半定量的着色强度结果,至少随机观察5～10 个HPF,取其均值[10]。

1.2.4 转录组测序 利用SiRNA敲低CAL-27细胞中KDM6A的表达。提取样本的总RNA后,将mRNA富集。将富集得到的mRNA反转录形成双链cDNA,纯化后构建文库并质检合格后上机测序。

1.3 统计学分析

运用GraphPad Prism 9.0进行绘图及统计学分析。

2 结 果

2.1 KDM6A与OSCC恶性程度负相关

利用Oncomine数据库中口腔鳞癌数据集进行癌与癌旁组织的差异表达分析,结果表明KDM6A在癌症组织中低表达,UTY高表达(图1A)。对TCGA数据库中566 例口腔鳞癌患者的生存曲线分析显示,KDM6A与UTY的较高表达与患者更好的总体存活期相关(图1B)。

图1 KDM6A与OSCC恶性程度及预后的相关性

综合分析以上结果,发现KDM6A可能与口腔鳞状细胞癌的恶性程度负相关,发挥肿瘤抑制的作用。结合临床病理信息分析发现,与StageII期、StageIII期、StageIV期相比,KDM6A在StageI期表达量较高;与T2、T3、T4相比,KDM6A在T1期表达量较高;但与患者淋巴结转移无关(图1C)。

为了验证上述结果,本研究在包含39 例癌症组织和19 例正常组织的组织芯片上进行KDM6A抗体免疫组织化学染色。结果表明KDM6A在癌症组织中低表达,随着OSCC恶性程度的增加KDM6A表达量下降(图1D为具有代表性的图像)。其中癌旁组织、鳞癌I级、II级、III级的阳性细胞计数分别为50%强度(+++),45%强度(++),25%强度(++),10%强度(+)。

2.2 KDM6A抑制OSCC的增殖和迁移

为了探究KDM6A对OSCC增殖和迁移能力的影响,本实验在转染了过表达KDM6A和空载对照组的CAL-27细胞中进行CCK8(图2B)和EDU增殖实验(图2C)。CCK8结果表明,过表达KDM6A后CAL-27细胞的增殖能力在36 h和48 h显著抑制。EDU实验结果也表明,过表达KDM6A抑制OSCC的增殖。为了探究KDM6A对OSCC迁移能力的影响,进行了Transwell(图2D)和划痕愈合实验(图2E)。结果表明与Vector组相比,过表达KDM6A显著抑制了OSCC细胞的迁移能力。

图2 过表达KDM6A抑制CAL-27的增殖和迁移

2.3 KDM6A可能通过Hippo 信号通路调控GSK3B抑制OSCC

敲低KDM6A并验证效率后(图3A),与空白对照组共同进行RNA-Seq。全基因组聚类分析显示,在敲低KDM6A后有1 462 个基因差异表达(图3B)。KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析结果显示,Hippo signaling pathway在敲低组明显富集(图3D)。选取下调基因GSK3B、LATS1、PPP1CB、BTRC,利用TCGA数据库进行共表达分析,发现它们的mRNA表达量与KDM6A的表达彼此正相关(图3E)。以上结果说明在敲低KDM6A后Hippo信号通路可能参与了OSCC的发生。

糖原合酶激酶GSK3B在敲低组下调显著,利用TCGA数据库进行生物信息学分析。结果表明,GSK3B的过高表达与患者预后更好的生存期相关,与肿瘤的恶性程度负相关。这表明GSKB3可能受KDM6A的调控并发挥抑制OSCC的作用。

3 讨 论

KDM6A在癌症中经常发生突变,并作为肿瘤抑制因子发挥作用,它可能通过相关转录因子和增强子上的MLL3/4复合体调节基因的表达[11-12]。然而,KDM6A也可能发挥促癌作用[13],最近有研究发现在 TAL1阳性细胞系中KDM6A的缺失导致凋亡增加,而KDM6A的过度表达促进细胞的生长[14]。KDM6A失活的效果并不一致,其在OSCC中的作用机制尚未见报道。

本研究通过生物信息学分析发现KDM6A在口腔鳞状细胞癌中低表达,并利用组织芯片免疫组化染色进行验证,结合临床病理信息分析结果,推测KDM6A在OSCC的发生发展过程中可能发挥肿瘤抑制的作用。为了验证此猜想,在CAL-27细胞中分别敲低和过表达了KDM6A,进行细胞增殖和迁移实验。结果表明KDM6A在体外能抑制口腔鳞状细胞癌增殖和迁移。

尽管许多研究指明了KDM6A通过调节不同的转录程序[15],在多种癌症类型中作为独立于其去甲基化酶活性的肿瘤抑制因子发挥作用[16]。组蛋白去甲基化酶KDM6A可以通过羟基化反应移除两种形式的甲基化修饰,通过激活此酶的活性可以调控组蛋白甲基化的异常,从而达到抑制相关疾病的目的[7]。然而,KDM6A调控OSCC发生的分子机制仍不清楚。本研究对KDM6A敲低的CAL-27细胞进行转录组测序,对测序结果进行统计分析,发现Hippo signaling pathway可能是KDM6A的下游信号通路。在OSCC中,Hippo信号通路的激活可抑制肿瘤的上皮间充质转化、恶性生物学行为及远处转移[17-18]。根据测序结果结合生物信息学分析初步探明,KDM6A可能通过Hippo信号通路调控GSK3B抑制OSCC。然而,探明KDM6A与Hippo信号通路相互作用的具体机制还需要更多的实验研究。

在临床上OSCC患者就诊时往往疾病已发展到晚期阶段并出现肿瘤转移,引起预后不佳。因此寻找口腔癌治疗的有效靶基因、探讨口腔癌发生的新途径,提高口腔癌患者的诊治率和生存率,是尤为重要的。