白术多糖对LPS诱导雏鹅脾脏免疫损伤的保护作用

郁浩胜,谢凌峰,陈天琪,李冰心,曹 楠,付新亮,田允波,许丹宁,李婉雁

(仲恺农业工程学院动物科技学院,广州 510225)

鹅由于天性喜水,鹅在我国的养殖模式都依赖于水体,此种养殖模式存在很多弊端,粪便等排泄物被排放至水体后,随着养殖时间的延长以及粪便的积累,水体中革兰氏阴性菌利用粪便中氮磷等物质不断繁殖,在细菌死亡后释放内毒素(LPS)[1］。由于天气和养殖环境等因素造成水体环境恶化,不能得到及时处理,形成污染源。水体中的细菌和LPS附着于粉尘颗粒漂浮在空气中,通过呼吸和采食进入雏鹅体内,在体内堆积无法完全排出,从而对机体造成不良影响。革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分是LPS。在生产中,革兰氏阴性菌感染会导致生理机能紊乱,免疫力降低引起免疫抑制等不良影响。脾脏是外周免疫器官,脾脏具有多种免疫细胞和因子,它们之间相互作用,相互调节,既可通过吞噬作用完成集体非特异性免疫,又可通过B、T细胞介导的体液免疫和细胞免疫发挥特异性免疫功能[2, 3］。T-bet和GATA-3分别表达于Th1和Th2细胞,T-bet和GATA-3的表达水平代表了Th1和Th2的水平;通过研究Th1和Th2的水平,达到治疗某些疾病的作用[4-5］。LPS的损伤机制主要作用上皮细胞、免疫细胞等靶细胞,使细胞表面分子异常,导致细胞的功能性损伤;或者激活免疫细胞,使免疫细胞分泌大量炎性介质引起炎症的发生。

近些年报道,中药提取物对畜禽的免疫方面有作用[6-7］。白术多糖(polysaccharide ofAtractylodesmacrocephalakoidz,PAMK)是中药白术的主要活性成分,具有绿色天然无毒无公害等作用特点。已有研究证实,白术多糖具有调节机体的免疫功能,维持机体免疫平衡,活化增殖免疫细胞的作用。前期研究表明,白术多糖具有维持机体免疫平衡,活化增殖免疫细胞等调节机体免疫功能的作用,然而白术多糖对于LPS引起的雏鹅脾脏损伤的研究还有待完善,因此本试验将对雏鹅腹腔注射LPS制备雏鹅炎症模型,试验期间通过饲料拌喂白术多糖来进行治疗,使用HE染色法、荧光定量PCR等试验方法,研究白术多糖对雏鹅脾脏的影响,为进一步应用在生产实践中提供理论基础。

1 材料方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 1日龄马岗鹅80羽(公母各半),购自清远金羽丰鹅业有限公司。

1.1.2 试验药物 白术多糖(CY201216),购自杨凌慈缘生物技术有限公司,纯度为95%,;脂多糖(L2880-100MG)购自美国Sigma Chemical公司。

1.1.3 主要试剂与仪器 Trizol(1559602)购自美国Ambion公司;反转录试剂(Rr036A)购自日本TaKaRa;实时定量PCR染料2×RealStar Green Fast Mixture with ROX Ⅱ(A304-10)购自北京康润诚业科技有限公司;荧光定量PCR仪器(ABI PRISM 7500 新加坡);光学显微镜。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组及饲养管理 试验选用80羽1日龄健康马岗鹅,随机分为对照组(CON组)、白术多糖(PAMK组)、脂多糖(LPS组)、白术多糖+脂多糖组(PAMK+LPS组),每组20羽。预饲3 d后,PAMK组和PAMK+LPS组饲喂添加400 mg/kg的白术多糖(纯水充分溶解后均匀喷洒在饲料表面后烘干)至试验结束。在24、26日龄时各进行一次注射给药,CON组和PAMK组雏鹅腹腔注射0.5 mL生理盐水;LPS组和LPS+PAMK组雏鹅腹腔注射2 mg/kg·BW LPS溶液,在26日龄注射结束1 h后,根据《仲恺农业工程学院实验动物福利要求》宰杀雏鹅并采集脾脏。本试验饲养期间均在仲恺教学试验基地专人饲养,雏鹅自由采食和饮水全程饲养、免疫程序及环境标准均按《马岗鹅肉鹅饲养管理技术规范》(广东省地方标准DB 44/T 1595-2015)执行。药物注射剂量参考前人研究结果[9］。

1.2.2 HE染色 每组随机抽取3羽雏鹅颈动脉放血处死后采集脾脏,4 %多聚甲醛中固定,制作常规石蜡组织切片,进行HE染色。利用光学显微镜观察脾脏组织结构形态,应用Photoshop软件计算动脉周围淋巴鞘面积。

1.2.3 实时荧光定量PCR 根据荧光定量PCR对引物要求,使用NCBI在线资源查找基因序列,设计合成引物,每组取6羽雏鹅并摘取脾脏,冷冻研磨脾脏组织,并进行RNA的提取,提取的RNA根据反转录试剂盒(Rr036A)说明书进行操作,得到cDNA。根据实时定量PCR染料(A25742)说明书配制反应体系,在实时荧光定量PCR仪器中检测,以β-actin作为内参基因,应用2-ΔΔct法计算出目的基因的mRNA表达水平。本试验的基因引物序列见表2,由生工生物工程股份有限公司合成。

表1 小鹅基础日粮组成及营养水平(风干基础)%

表2 荧光定量PCR引物

预混料为每千克日粮提供VA 5 000 IU,VD3 2 000 IU,VE 40 mg,VB1 2.5 mg,VB2 4 mg,VB6 4 mg,生物素biotin 0.2 mg,VB12 12 μg,泛酸钙cal￣cium pantothenate 15 mg,Fe 90 mg,Cu 8 mg,Zn 70 mg,Mn 90 mg,Se 0.3 mg。

粗蛋白为实测值,其余营养水平为计算值。

1.2.4 数据处理与分析 脾脏动脉周围淋巴鞘面积、细胞因子等数据统计均使用SPSS26.0软件进行单因素方差分析,所有数据均以“平均值±标准误(MEAN±SEM)”表示,P<0.05时表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 PAMK对LPS处理下雏鹅脾脏组织形态的影响 由图1可知,与CON组和PAMK组相比,LPS组的脾脏细胞排列疏松、细胞损伤萎缩,形态各异,细胞数目减少并伴有凋亡现象,与LPS组相比,LPS+PAMK组的细胞排列紧密,细胞形态正常。与CON组和PAMK组相比,LPS组的动脉周围淋巴鞘面积显著缩小(P<0.05),LPS+PAMK组的动脉周围淋巴鞘面积无显著性差异(P>0.05)。上述结果表明PAMK能有效缓解LPS造成的脾脏组织损伤。

2.2 PAMK对LPS处理下雏鹅脾脏组织中炎性细胞因子的mRNA相对表达量的影响 IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ参与调节机体免疫机能,在免疫系统中发挥关键作用。利用荧光定量PCR检测IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ的mRNA表达水平。结果如图2所示,LPS组IL-1β、IL-6表达水平显著高于CON组和PAMK组(P<0.05),但LPS+PAMK组与LPS组相比,IL-1β、IL-6表达水平显著降低(P<0.05);LPS组IL-4表达水平高于CON组(P>0.05),但LPS+PAMK组与LPS组相比,IL-4表达水平显著下降(P<0.05);LPS组TNF-α表达水平低于CON组(P>0.05),但LPS+PAMK组与LPS组相比,TNF-α表达水平显著升高(P<0.05);LPS组IFN-γ表达水平显著低于CON组(P<0.05),但LPS+PAMK组与LPS组相比,IFN-γ表达水平显著升高(P<0.05)。结果表明,PAMK能够显著下调脾脏组织中炎性细胞因子的mRNA表达量,维持炎性细胞因子表达水平的相对稳定。

图中数据柱上方的字母用于表示组间差异,字母相同则表示两组间没有差异(P>0.05),若字母不同则表示两组间存在显著性差异(P<0.05)。The letters above the data column in the figure are used to indicate inter group differences. If the letters are the same, it means there is no difference between the two groups (P>0.05). If the letters are different, it means there is a significant difference between the two groups (P<0.05).

2.3 PAMK对LPS处理雏鹅脾脏GATA-3与T-bet表达量变化 图3结果显示,LPS组GATA-3表达水平显著低于CON组和PAMK组(P<0.05),但LPS+PAMK组与LPS组相比,GATA-3表达水平显著升高(P<0.05);LPS组T-bet表达水平显著低于CON组(P<0.05),但LPS+PAMK组与LPS组相比,T-bet表达水平显著升高(P<0.05)。结果表明,PAMK能调节LPS处理雏鹅脾脏中GATA-3、T-bet的mRNA表达量,使其接近对照水平。

图3 PAMK对LPS处理雏鹅脾脏GATA-3与T-bet表达量变化的影响

3 讨论与结论

脾脏是鹅体内最大的外周免疫器官,其主要功能主要是通过清除免疫过程中机械损伤或异常的细胞来保护机体以降低各种病原的侵害,脾脏也能产生各种炎性因子调控机体免疫平衡。90%的血液流经脾脏,在抗感染和获得性免疫应答方面有重要作用,同时脾脏也是细病原体对机体产生免疫抑制作用的靶器官。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,通过与机体细胞表面结合触发多种信号通路并释放细胞因子,是导致全身炎症和多器官功能衰竭的重要发病机制。LPS是通过激活体内的淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等免疫细胞,这些细胞分泌促炎性细胞因子激活信号通路,引发细胞损伤导致器官衰竭。LPS被大量实验用作建立细菌感染的炎症动物模型。[10］。研究认为脾脏实质中含有大量T、B淋巴细胞,淋巴细胞是免疫系统中至关重要的细胞群,主要参与细胞的免疫调节和执行细胞免疫功能的作用。因此,雏鹅脾脏的生长发育及组织结构形态的变化,均对雏鹅的免疫功能研究有重要意义。

本研究表明,LPS组雏鹅脾脏的细胞形态发生改变,形态各异,细胞间排列疏松,细胞数目减少,并有凋亡现象,组织结构及细胞损伤导致炎症的发生;动脉周围淋巴鞘主要聚集大量T细胞,HE染色结果显示,脾脏组织动脉周围淋巴鞘面积显著缩小,显著影响了雏鹅脾脏组织结构,表明细胞免疫功能降低,造成了严重损伤,这也说明LPS诱导的雏鹅免疫抑制模型构建成功。据先前研究,在饲粮中添加400 mg/kg的PAMK能够对机体起到一定保护作用[11］,前期结果也证实这一点,但PAMK对LPS诱导雏鹅炎症的保护机制尚不明确。

本研究表明,LPS通过增加IL-1β、IL-4、IL-6和降低TNF-α、IFN-γ等细胞因子表达水平从而导致机体免疫系统失衡甚至直接造成炎症损伤。很多植物性多糖的研究也在证实,在机体处于炎症状态下,它们可以促使淋巴细胞增多、改善脾脏组织结构[12, 13］、调控炎性因子表达水平和抑制脾脏细胞的凋亡,从而缓解LPS带来的影响[14, 15］。本试验结果显示,PAMK+LPS组显著降低了IL-1β、IL-6的表达,显著增加了TNF-α、IFN-γ的表达,这可能是PAMK调节免疫水平和缓解细胞损伤的途径之一。

Th1主要介导细胞免疫,具有免疫杀伤作用,可促进B细胞产生抗体,在特异性自身免疫疾病和抗感染免疫中起重要调节作用,T-bet是Th1的关键性转录因子,主要作用包括抗病毒、抗肿瘤、抗寄生虫感染等,在促进Th0向Th1分化过程中起决定性作用,T-bet的表达量升高,可促进Th1的分化,抑制Th2细胞产生,调节Th1免疫反应[15-18］。Th2主要参与调节体液免疫反应,GATA-3是Th2的关键性转录因子,GATA-3的表达量升高,促进了Th0向Th2的分化,调节Th2的免疫反应[18, 19］。有报道指出,GATA-3在机体造血过程中也有作用[20］。本研究表明,LPS显著降低了GATA-3和T-bet的mRNA转录水平表达,白术多糖显著上调了脾脏淋巴细胞中Th1和Th2细胞的特异性转录因子GATA-3和T-bet的mRNA转录水平,进而促进Th1细胞因子(TNF-α和IFN-γ)及Th2细胞因子(IL-4和IL-6)的mRNA表达。这表明PAMK通过调节脾脏中GATA-3和T-bet的表达量改善了LPS对雏鹅炎症反应,维持免疫功能的相对稳定。

PAMK可以通过调节体内炎性因子和转录因子的表达缓解LPS诱导的雏鹅脾脏免疫炎症反应,并维持脾脏的正常组织结构。