褪黑素对动物机体免疫调节的研究进展

吕品一, 刘国世, 胡艳欣, 李 翔

(1.华中农业大学动物科学技术学院 、 动物医学院, 湖北 武汉 430070 ; 2.中国农业大学动物科技学院,北京 海淀 100193 ; 3.中国农业大学动物医学院, 北京 海淀 100193)

褪黑素(Melatonin,MT)又称N-乙酰-5-甲氧基色胺,是主要由松果体产生的一种胺类激素。1959年,Lerner等从牛松果体提取物中分离出一种能使青蛙皮肤褪色的物质,将其命名为褪黑素[1]。褪黑素具有诸多生理功能,除了最被人熟知的调节昼夜节律和改善睡眠质量之外,褪黑素还具有内源性自由基清除作用,可以防止细胞产生氧化损伤。同时,褪黑素兼具免疫调节作用,可对动物机体天然免疫和获得性免疫进行调节,其免疫调节机制广泛且复杂[2]。近年来,对于褪黑素不同生理功能及其作用机制的研究很多,本文对褪黑素介导的动物免疫调节功能及其机制的最新研究进展进行综述,以期为后续褪黑素相关研究提供思考和见解,提高动物生产效率。

1 褪黑素概述

褪黑素来源广泛,对机体没有明显的毒副作用,其分子式为C13H16N2O2,分子量为232.27,熔点为 116～118 ℃,易溶于乙醇和苯,微溶于水,化学稳定性好,在生物体内具有高脂溶性、低水溶性和低血浆蛋白结合力的特征。褪黑素的生物合成具有昼夜节律性和季节特征[3],与外界环境光照条件相关[4]。除松果体外,大部分组织器官,如视网膜、胃肠道和性腺等都能够合成褪黑素,而松果体呈现周期性的褪黑素分泌活动。

褪黑素的生物合成和代谢经历多个步骤和多种酶的调控。褪黑素在所有组织中的生物合成均起源于色氨酸[5],松果体从血液中摄取色氨酸后,先后在色氨酸羟化酶、L-氨基酸脱羟酶、5-羟色胺-N-乙酰转移酶和羟化-氧-甲基移位酶的作用下转变为褪黑素。褪黑素在体内经历多个代谢途径。首先,褪黑素被褪黑素酶催化,转化为羟基褪黑素;羟基褪黑素可以进一步代谢为羟基褪黑素酮和羟基褪黑素酸,这些代谢产物通过肝脏和其他组织最终被排泄。

2 褪黑素对获得性免疫的调节

2.1 胸腺依赖性淋巴细胞(T细胞)和细胞免疫 T细胞主导细胞免疫,在免疫过程中发挥多种功能,如直接杀伤靶细胞、辅助或抑制B细胞产生抗体、对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等[6]。褪黑素可通过调节T细胞增殖、T细胞活化和不同种类T细胞比例这3种途径调节细胞免疫。

2.1.1 调节T细胞增殖 已有研究表明,大鼠在松果体被摘除后,由于褪黑素分泌减少而出现胸腺萎缩和体重减轻的现象,且显著程度随时间加剧,补充褪黑素能使该进程逆转,胸腺重量明显恢复[7]。同时,摘除松果体使大鼠胸腺酪氨酸激酶受体B(Tyrosine kinase receptor B,trkB)表达量下降,而使用外源性褪黑素后trkB的表达量可恢复正常,胸腺细胞和胸腺巨噬细胞表达的trkB共同参与胸腺细胞的分化发育,褪黑素可以通过神经内分泌调节保护胸腺细胞[8]。有研究表明,摘除松果体可导致大鼠胸腺叉头蛋白P3(Forkhead box protein P3,Foxp3)的转录和翻译明显增加,而补充外源性褪黑素后能使Foxp3的表达下降至正常水平[9]。Xiong等对切除松果体的肉鸡使用外源性褪黑素发现,褪黑素可增强绿光诱导的脾脏T细胞增殖,通过使用不同受体拮抗剂并测定淋巴细胞活性发现,褪黑素通过与膜受体Mel1a和Mel1c结合参与调节T细胞增殖[10]。

2.1.2 调节T细胞活化 Yoo等使用100周龄老年小鼠脾细胞和CD4+T细胞进行试验,结果显示,使用褪黑素后,CD28、p21、褪黑素受体(Melatonin receptor,MTR)-1A和MTR-1B基因mRNA高度表达,促进T细胞活化,老年小鼠脾细胞和CD4+T细胞的数量显著增加,且记忆T细胞得到长期维持,表明褪黑素可以强化老年小鼠的免疫力[11]。另一项试验中,研究人员对小鼠采用松果体切除术,之后分析补充褪黑素后T细胞的变化,第4和6周后,T细胞活化因子显著上调,且呈剂量依赖性[12]。

2.1.3 调节不同种类T细胞比例 研究表明,褪黑素能显著影响T细胞的分化发育和释放,通过改变不同种类T细胞的比例来调节免疫。大鼠摘除松果体后,胸腺和血液中CD4+T细胞比例无明显波动,CD8+T细胞比例在胸腺中上升,在血液中下降,补充褪黑素后逐步恢复,且呈剂量依赖性[13]。周爱民等使用免疫抑制模型小鼠对CD4+和CD8+T细胞的比值和百分含量进行研究,结果显示,在正常小鼠中,CD4+/CD8+T细胞比值正常,辅助性T细胞(Helper T cell,Th)/抑制性T细胞(Suppressor T cell,Ts)比值不变,褪黑素通过增加CD4+和CD8+T细胞的百分含量提高细胞免疫功能,发挥免疫调节作用;对于免疫功能低下或缺陷的小鼠,褪黑素通过提高CD4+和CD8+T 细胞的百分含量,改变CD4+/CD8+T细胞的比值和Th/Ts的比值而发挥免疫增强作用[14]。Huang等通过建立自身免疫性葡萄膜炎(Experimental autoimmune uveitis,EAU)小鼠模型并腹膜内注射褪黑素研究EAU的治疗机理,结果显示,褪黑素可以通过抑制转录因子进而限制外周Th1和Th17的增殖,抑制视网膜特异性T细胞对Th1和Th17细胞的极化,同时提高调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)的比例,从而调节自身免疫[15]。摘除松果体后,大鼠胸腺CD4+CD25+Treg细胞的输出增加,补充褪黑素可使胸腺CD4+CD25+Treg细胞产生增加、输出下降,若长时间补充褪黑素则该影响逐渐消失[9]。值得注意的是,即便有不少研究都提出改变不同种类T细胞的比例可以调节免疫,但关于褪黑素改变T细胞比例的具体机制尚存空白,值得进一步探究。

2.2 骨髓依赖性淋巴细胞(B细胞)和体液免疫 B细胞主导体液免疫,成熟的B细胞接受抗原刺激后,在抗原提呈细胞和Th细胞的辅助下成为活化B细胞,进而分化为浆细胞,合成和分泌各类抗体[6]。褪黑素可通过调节B细胞增殖、B细胞活化和抑制B细胞凋亡这3种途径调节体液免疫。

2.2.1 调节B细胞增殖 Yu等给16周龄小鼠喂食含褪黑素日粮发现,褪黑素处理组小鼠骨髓中前体B细胞凋亡率显著下降,口服褪黑素可促进小鼠骨髓中前体B细胞的存活[16],从而影响B细胞增殖成熟数量。体外给予外源性褪黑素可显著增强法式囊B淋巴细胞的增殖[17]。B细胞通过与膜受体Mel1b、Mel1c和维甲酸相关孤核受体(Retinoic acid receptor related-orphan receptors,RORs)结合参与调节B细胞增殖[8]。

2.2.2 调节B细胞活化 研究表明,松果体切除小鼠补充褪黑素后第4和6周后,B细胞活化因子显著上调,且呈剂量依赖性[12]。Ramos等对接种过结节拟杆菌疫苗的绵羊进行褪黑素的植入或注射发现,配合使用了褪黑素的绵羊外周血液中抗体滴度比单独接种疫苗更高,且褪黑素增加了接种疫苗绵羊的IgG+B淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞的数量,表明褪黑素可增强B细胞活化并继发增强体液免疫[18]。

2.2.3 抑制B细胞凋亡 Zhang等在不同单色光组合条件下对雏鸡使用外源性褪黑素后发现,在绿蓝单色光组合条件下,核受体RORα和RORγ可以通过减少氧化应激和核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)的表达,抑制法式囊B淋巴细胞凋亡[19]。

综上所述,褪黑素通过Mel1a、Mel1b、Mel1c等不同种类的膜受体和RORα、RORγ等不同种类的核受体,调节多种细胞活化因子或改变不同种类细胞比例,对T细胞主导的细胞免疫和B细胞主导的体液免疫进行调节,参与调控动物机体获得性免疫的多个环节(图1)。

图1 褪黑素对获得性免疫的调节

3 褪黑素对天然免疫的调节

3.1 自然杀伤(Natural killer,NK)细胞 NK细胞是动物机体天然免疫的重要组成部分,在抗病毒、抗肿瘤和免疫调节中起着关键作用,无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞[6]。褪黑素对NK细胞的影响主要体现在数量和活性2个方面。

3.1.1 调节NK细胞数量 射频消融术(Radiofrequency ablation,RFA)是指在动物体内采用尖端射频热以精准消融增生组织和肿瘤,使相应的器官恢复功能。研究表明,RFA和褪黑素联合治疗可显著增加NK细胞在非消融肿瘤组织中的浸润,提高NK细胞的抗肿瘤活性。Currier等研究发现,与未添加褪黑素的小鼠相比,在食物中添加外源性褪黑素的小鼠脾脏和骨髓中的NK细胞数量在7和14 d后均显著上升[20]。

3.1.2 调节NK细胞活性 将NK细胞和人慢性髓原白血病细胞(K-562细胞)在含有褪黑素的培养基中共同培养,结果显示,增加褪黑素浓度可以有效提高NK细胞的活性,促进NK细胞介导的K-562细胞杀伤[21]。类似地,Özçelik等使用链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病,并对其使用褪黑素进行为期6周的腹膜内注射,结果显示,注射褪黑素的大鼠NK细胞活性显著升高[22]。有关褪黑素能够对NK细胞数量和活性进行调节作用的具体原因尚待研究。

3.2 单核-巨噬细胞系统 单核-巨噬细胞是机体重要的免疫细胞,可通过非特异性吞噬起到抗感染作用,同时兼具抗原递呈及启动免疫应答、抗肿瘤等作用[6]。褪黑素可对单核-巨噬细胞的数量比例和分泌状态产生影响。

3.2.1 调节单核-巨噬细胞数量比例 在Currier等的研究中,对成年雄性小鼠使用褪黑素7 d后,小鼠骨髓和脾脏中单核细胞的数量都发生了显著上升;14 d后骨髓中单核细胞数量维持在高水平[20]。另有研究发现,褪黑素通过将外泌体αKG转运到巨噬细胞并促进TET(Ten-eleven translocation,TET)蛋白介导的脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)去甲基化,缓解了脂肪细胞炎症,提高了替代性活化巨噬细胞(Alternatively activated macrophage,M2)的比例,同时减少了巨噬细胞的死亡数量[23]。一项对产毒素大肠杆菌感染的研究结果显示,褪黑素改变了猪巨噬细胞的功能,降低了其抑菌和杀菌活性,同时显著降低了细胞外乳酸脱氢酶活性,表明褪黑素可降低产毒素大肠杆菌导致的巨噬细胞死亡。但有趣的是,在褪黑素影响下,猪巨噬细胞的细菌清除率反而得到了增强[24]。可见,褪黑素对巨噬细胞的影响效果尚不明确,具体机制尚待进一步研究。

3.2.2 调节单核-巨噬细胞分泌状态 研究显示,由于夜间佩戴牙齿矫正器会产生机械作用,RAW264.7巨噬细胞受其影响后会产生更多炎症介质,如白细胞介素(Interleukin,IL)1β和IL-6等;但添加褪黑素后,褪黑素可通过MT2受体抑制巨噬细胞产生炎症介质,从而抑制因机械作用而导致的炎症反应[25]。小胶质细胞由单核细胞发育而来,在中枢神经系统中发挥免疫吞噬作用。Liu等建立脑缺血小鼠模型并向其腹腔注射褪黑素进行体内试验,同时对促炎状态的小胶质细胞使用褪黑素进行体外试验,结果显示,褪黑素可通过信号转导和转录激活因子-3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)依赖性方式将小胶质细胞从促炎状态转变为抗炎状态,改善缺血性卒中后炎症反应引起的脑损伤[26]。

3.3 炎症小体 炎症小体是由胞浆内模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)参与组装的多蛋白复合物,是天然免疫系统的重要组成部分。炎症小体的激活能够帮助宿主免疫外来病原体,但其过度激活会导致免疫病理损伤。而褪黑素可以通过抑制激活信号、抑制炎症小体的主要成分合成等方法抑制炎症小体的活化[27]。

3.3.1 抑制激活信号 NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎症小体在小鼠急性肺损伤中起关键作用,而褪黑素能够通过抑制作为激活炎症小体第2信号的胞外组蛋白的功能来抑制或直接抑制该小体的激活,这可能是褪黑素治疗急性肺损伤的机制[28]。用褪黑素处理脊髓损伤小鼠模型后发现,褪黑素通过刺激NF-E2相关因子2-抗氧化反应元件通路(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2-antioxidant response element,Nrf2-ARE)抑制NLRP3炎症小体,从而抑制神经炎症,改善脊髓损伤后神经功能的恢复[29]。

3.3.2 抑制炎症小体的主要成分合成 褪黑素可以剂量依赖性降低IL-1β,抑制NLRP3炎症小体的激活和焦亡[30]。Crespo等在使用褪黑素对兔出血性病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)诱导的急性肝功能衰竭模型兔进行处理后发现,褪黑素可通过抑制NLRP1炎症小体的主要成分凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、Caspase-1 (CASP1)蛋白、IL-1β和IL-24β的增加,防止感染RHDV兔的肝脏中NLRP3炎症小体的活化,从而在一定程度上防止急性肝功能衰竭的发生[31]。另一项试验使用褪黑素处理肺动脉高压小鼠模型,结果显示,褪黑素可通过调节巨噬细胞中的钙离子来减少炎症小体多蛋白复合物的形成,同时褪黑素膜受体激动剂可使巨噬细胞中的炎症小体失活,减轻炎症小体相关的血管疾病[32]。

综上所述,褪黑素对NK细胞、单核-巨噬细胞和炎症小体均可产生影响,通过较为多样且复杂的途径调节动物机体天然免疫(图2)。

图2 褪黑素对天然免疫的调节

4 褪黑素对细胞因子的调节

细胞因子是免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质,是调控免疫应答的重要因素,也是引起动物机体损伤和多脏器衰竭的重要原因[6]。褪黑素对于细胞因子的产生具有抑制作用。研究发现,鼻黏膜和肺组织中的褪黑素在白天的表达量显著高于夜晚,流感病毒感染小鼠的存活率与呼吸道组织中褪黑素的表达量呈正相关;进一步研究表明,褪黑素可通过MT2受体结合并下调肥大细胞低氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)通路相关因子的表达,通过抑制肥大细胞活化,减少促炎因子,如肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-2和IL-9β等的释放,从而减轻H1N1亚型流感病毒感染小鼠后由细胞因子风暴所产生的肺泡上皮细胞凋亡和肺损伤(图3)[33]。

图3 褪黑素保护小鼠免受H1N1感染的潜在机制示意图[33]

在一组多发性硬化症患者的对照研究中发现,连续6个月每日口服25 mg褪黑素能显著降低血清中TNF、IL-6和IL-1β等细胞因子和脂质过氧化物的含量,对细胞因子所导致的神经损伤有抑制作用[34]。Brazão等在对克鲁兹锥虫感染的研究中发现,褪黑素处理后大鼠血清中的IL-1α、IL-1β和转化生长因子 (Transforming growth factor β,TGF-β)等细胞因子浓度显著降低[35]。在对褪黑素调节幽门螺杆菌感染所致胃炎的研究中发现,与感染对照组相比,小鼠血清IL-2、IL-6、IL-10、干扰素γ(Interferon-γ,IFN-γ)和TNF-α等各细胞因子在褪黑素干预6周后显著下降[36]。

总结既往研究可以得出,褪黑素对多种细胞因子的产生均可起到抑制作用,这可能与产生细胞因子的对应细胞活性受褪黑素抑制有关(图4)。但对大多数种类的细胞因子而言,褪黑素抑制其产生的精确机制尚有待探索。

图4 褪黑素对细胞因子的调节

5 总结与展望

褪黑素作为一种内源性神经生殖激素,具有抗氧化功能,在免疫调节中扮演着重要的角色。研究表明,褪黑素能够调节免疫细胞、免疫器官的功能和活性,可以对不同种类的细胞因子和炎症小体进行调节,对天然免疫和获得性免疫均具有广泛的影响。然而,对于褪黑素在免疫调节中所产生现象背后的具体机制的认识,例如褪黑素如何改变T细胞的比例、如何提高NK细胞活性、如何使动物机体中细胞因子水平下降等,仍然有待进一步深入探究。未来的研究可以着眼于深入了解褪黑素与免疫细胞之间的相互作用、信号转导通路以及调控免疫反应的分子机制,同时进一步探索褪黑素在自身免疫病和免疫肿瘤治疗等领域的临床应用,以期将褪黑素的免疫调节潜力转化为临床治疗的创新方法。