富含EPA/DHA结构脂高内相乳液的制备及其稳定性

聂小华,汪凌云,黄宝柱,孟祥河,余宁翔,陆元超

(浙江工业大学 食品科学与工程学院,浙江 杭州 310014)

结构脂是通过化学法或酶法改变甘油酯分子中的脂肪酸组成和位置分布而得到的结构甘三酯[1],其具备特殊的功能特性。EPA/DHA为ω-3多不饱和长链脂肪酸,具有提高免疫力,预防肥胖、癌症等优点[2]。一般来说,深海鱼和海藻来源的油脂中EPA/DHA质量浓度较低,常被转化成乙酯型产品,以提高EPA/DHA质量浓度,然而乙酯型产品普遍存在生物可及性低等问题[3]。近年来,科研工作者关注富含EPA/DHA结构脂的制备[4],其产品的进一步开发与应用研究尚未有报道。高内相乳液(High internal phase emulsions,HIPE)是指分散相体积分数≥74%的一类凝胶乳液[5],多为液滴紧密排列的六面体结构,可作为乳脂替代品、特殊营养功能物或其他保健品的功能性营养配料[6]。HIPE的制备通常需要乳化剂,而小分子表面活性剂在乳滴表面的吸附能力较弱,稳定乳液的效果较差,且其对人类健康有不利影响,难以广泛应用于食品工业。相较之下,蛋白质、多糖等天然大分子物质,具有两亲性基团、乳化能力强、生物相容性良好以及易降解等特点,逐渐成为制备HIPE的首选。研究表明:多糖与蛋白质复合、蛋白质与蛋白质复合、多糖与多糖复合,往往会改善单一物质的乳化能力,提高乳液稳定性,如乳清蛋白-果胶[7]和小麦醇溶蛋白-壳聚糖[8]。此外,HIPE的胶凝性与油脂中脂肪酸种类和组成有着密切关联。现有研究集中于大豆油等植物油脂,利用结构脂制备HIPE具有较好的前沿性和实用价值。

综上,笔者以富含EPA/DHA的结构脂为原料,采用大豆分离蛋白和高酯果胶、壳聚糖等制备其HIPE,考察蛋白与多糖复合对HIPE形成、乳液粒径、流变性能、热稳定性和冻融稳定性的影响,旨在为结构脂的产品开发及其在食品领域的应用提供理论基础与实践参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

富含EPA/DHA结构脂(EPA/DHA总质量分数58%),实验室自制;大豆分离蛋白(SPI,蛋白质量分数≥90%),河南千志商贸有限公司;高酯果胶(PE,酯化度≥65%),上海郁溪生物科技有限公司;壳聚糖(CS,低分子质量10～20 kDa),上海阿拉丁试剂有限公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

MIULAB-10K+C微型离心机,杭州米欧仪器有限公司;JY5002电子天平,上海舜宇恒平科学仪器有限公司;T18高速分散机,德国IKA公司有限公司;BX 51光学显微镜,日本OLYMPUS公司;BS-224S分析天平,赛多利斯科学仪器有限公司;TA-Q200差示扫描量热仪,美国TA设备有限公司;RS600哈克流变仪,德国哈克公司;PHS-2F pH计,上海精科仪器有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 大豆分离蛋白溶液的制备

大豆分离蛋白分散于蒸馏水中,使其质量浓度为50 mg/mL,采用浓度为1 mol/L HCl溶液调节pH至3;并加入叠氮化钠(终质量浓度0.2 mg/mL)以抑制微生物生长。将配制好的大豆分离蛋白溶液置于4 ℃冰箱中过夜,使蛋白充分水合。

1.3.2 大豆分离蛋白-多糖混合液的制备

大豆分离蛋白溶液中分别加入高酯果胶和壳聚糖,多糖质量浓度为5～20 mg/mL;振荡形成大豆分离蛋白-多糖混合液,采用1 mol/L HCl溶液将混合液的pH调至3,备用。

1.3.3 富含EPA/DHA结构脂HIPE的制备

向上述大豆分离蛋白-多糖混合液中加入体积分数为80%的富含EPA/DHA结构脂,高速均质(11 000 r/min,2 min),形成蛋白/多糖稳定的HIPE,4 ℃下贮藏。

1.3.4 富含EPA/DHA结构脂HIPE的类型判断

运用分散法判断乳液类型[9]。HIPE滴入油或水中观察其分散性,确定高内相乳液类型。

1.3.5 乳液稳定性的分析

采用离心法进行乳液稳定性的评价[10]。取一定量的HIPE于离心管中,高速离心(8 000 r/min,15 min),测定离心后HIPE析出的油水总质量,并计算离心稳定性,计算式为

(1)

式中:W1为HIPE总质量;W2为HIPE离心后析出的油水总质量。

1.3.6 光学显微镜观察

使用BX51光学显微镜观察乳液的微观结构[11]。将20 μL HIPE滴到载玻片上,使用盖玻片固定并确保内部没有气泡,观察乳液的尺寸、形状和分布。

1.3.7 乳液平均粒径的测定

采用相同pH值的蒸馏水稀释HIPE,Malvern 3000激光粒度仪测定乳液的平均粒径[12]。

1.3.8 流变性能测定

使用高级旋转流变仪分析乳液流变性能[13]。将HIPE置于平行板(直径25 mm,间隙1 mm),在应变值为0.5%,温度为25 ℃,扫描频率为0.1～100 Hz的条件下,测量乳液的弹性模量G′和黏性模量G″。

1.3.9 热稳定性测定

取1 mL HIPE于离心管中,70 ℃下加热60 min后高速离心(8 000 r/min,15 min);测定HIPE析出的油水总质量,按1.3.5方法计算热处理后的离心稳定性。

1.3.10 冻融稳定性测定

取1 mL HIPE于离心管中,-20 ℃下放置24 h后,于30 ℃水浴下解冻2 h,作为1次冻融循环,如此反复进行3次。测定HIPE析出的油水相体积,计算冻融稳定性,计算式为

(2)

式中:V总为HIPE总体积;V水+油为析出油水层体积。

1.4 数据统计与分析

所有数据均为3次平行测定的平均值,结果表示为平均值±标准差。采用SPSS19.0和Origin8.5软件对实验数据分析处理。

2 结果与讨论

2.1 HIPE的类型判断

富含EPA/DHA结构脂HIPE分别滴入大豆油与蒸馏水中观察其分散性,以确定乳液类型。如果乳液不溶于油,而是均匀分散在水中,则为水包油(O/W)乳液;如果乳液可均匀分散在油中,则为油包水(W/O)乳状液[9]。HIPE在油中与水中的分散状态如图1所示,富含DHA/EPA结构脂HIPE虽然不分散于油中并保持其原有状态,但在水中有效分散,表明其为水包油(O/W)型高内相乳液。

图1 HIPE在油与水中的分散状态Fig.1 Dispersion state of HIPE in oil and water

2.2 HIPE的外观与离心稳定性

乳液外观和离心处理能反映HIPE形成与稳定性[10]。大豆分离蛋白与多糖协同稳定的富含EPA/DHA结构脂HIPE外观与离心稳定性分别如图2和表1所示。表1中:组别编号1为50 mg/mL SPI;2为50 mg/mL SPI+5 mg/mL PE;3为50 mg/mL SPI+10 mg/mL PE;4为50 mg/mL SPI+15 mg/mL PE;5为50 mg/mL SPI+20 mg/mL PE;6为50 mg/mL SPI+5 mg/mL CS;7为50 mg/mL SPI+10 mg/mL CS;8为50 mg/mL SPI+15 mg/mL CS;9为50 mg/mL SPI+20 mg/mL CS,以下同。50 mg/mL SPI溶液稳定的HIPE仍具有一定流动性,该结果与10 mg/mL SPI溶液稳定大豆油HIPE[16]的研究存在很大差距,这应该与脂类的黏度有关,一般来说中链脂肪酸和多不饱和脂肪酸的黏度较低,具有较大的流动性。大豆分离蛋白与高酯果胶、壳聚糖复合后,HIPE呈现倒置不流动;高速离心后其油水析出情况得到改善,随着多糖质量浓度的增加,油水析出量减少,甚至无析出,如50 mg/mL SPI+20 mg/mL CS组,乳液结构保持完整。与50 mg/mL SPI组相比,50 mg/mL SPI+20 mg/mL PE组和50 mg/mL SPI+20 mg/mL CS组离心稳定性有明显提高,分别达到了87.13%和95.77%,说明乳液具有很高的稳定性。蛋白—多糖协同可提高HIPE稳定性,这是因为:1) 多糖本身具有一定的乳化性能,其与蛋白复合时,在油—水处形成致密的界面膜,有利于形成粒径较小的油滴;2) 多糖可增加水相黏度,限制油滴在水相中的扩散速度和疏水缔合。此外,高酯果胶和壳聚糖本身在酸性环境中可形成凝胶网状结构[14],从而得到了更稳定的凝胶状乳液。

SPI—大豆分离蛋白;PE—高酯果胶;CS—壳聚糖。图2 大豆分离蛋白-多糖协同稳定的HIPE外观Fig.2 Images of HIPE prepared by SPI and polysaccharides

表1 大豆分离蛋白-多糖制备的HIPE离心稳定性

2.3 HIPE的微观结构和平均粒径

大豆分离蛋白与多糖协同稳定的富含EPA/DHA结构脂HIPE微观结构和平均粒径分别如图3,4所示。50 mg/mL SPI溶液单独稳定的HIPE中油滴大小分布较为分散,存在凝聚形成的大油滴,这说明其还不足以稳定小油滴的界面面积,凝胶结构强度弱,内部的小油滴发生扩散,通过疏水相互作用絮凝成大油滴[11];大豆分离蛋白分别与高酯果胶、壳聚糖复合后,可有效降低HIPE中油滴的尺寸。此外,所有的HIPE均为微米级乳液;50 mg/mL SPI溶液单独稳定的HIPE平均粒径为38.69 μm,而黄子璇[15]采用10 mg/mL SPI溶液稳定的大豆油HIPE平均粒径就达到了40.92 μm,这进一步说明脂肪酸的碳链长度和饱和度会影响乳液粒径。HIPE的平均粒径随着多糖质量浓度的增加而减小,其中50 mg/mL SPI+20 mg/mL PE组和50 mg/mL SPI+20 mg/mL CS组平均粒径分别降低到20.82 μm,16.06 μm。实验结果说明高酯果胶和壳聚糖均可有效提高大豆分离蛋白对富含EPA/DHA结构脂的乳化性能。蛋白与多糖协同发挥乳化作用,稳定小油滴的界面,从而降低油滴粒径[12],同时水相黏度的增加也阻止小油滴扩散聚集成大油滴。

图3 大豆分离蛋白与多糖协同稳定的HIPE光学显微图Fig.3 Microstructure of HIPE prepared by SPI and polysaccharides under optical microscope

图4 大豆分离蛋白与多糖协同稳定的HIPE平均粒径Fig.4 Average particle size of HIPE prepared by SPIand polysaccharides

2.4 HIPE的流变性能

为探究大豆分离蛋白与多糖协同稳定的富含EPA/DHA结构脂HIPE流变行为,采用频率扫描来考察其的弹性模量G′和黏性模量G″,结果如图5所示。测试范围内(0.1～100.0 Hz)所有HIPE的弹性模量始终远大于黏性模量,说明其具有以弹性为主的类固体性质。随着多糖质量浓度从5 mg/mL增加到20 mg/mL,HIPE的弹性模量明显增大,说明其结构的弹性增强。这可能是因为多糖分子在连续相中呈链状,可填充油滴间隙,并与蛋白形成互穿网络聚合物,使乳滴间的堆积更致密紧实,提高HIPE凝胶网络的强度。彭秀清[16]也发现果胶可改善大豆分离蛋白荷载姜黄素乳液的流变特性,果胶质量浓度越高,乳液的弹性越高。

图5 大豆分离蛋白与多糖协同稳定的HIPE弹性模量G′和黏性模量G″Fig.5 Elastic modulus G′ and viscous modulus G″ of HIPE prepared by SPI and polysaccharides

2.5 HIPE的热稳定性

热处理是常见的食品加工工艺,所以良好的热稳定性对乳液的实际应用有重要意义[10]。图6和表2是富含EPA/DHA结构脂HIPE的热稳定性情况。由图6可知:70 ℃下处理60 min,所有HIPE的外观未发生明显变化,未观察到油水析出,乳液结构保持完整,说明其具有良好的热稳定性;与未热处理的离心稳定性(表1)相比较,热处理后HIPE的离心稳定性虽然略有下降,但二者之间并无显著差异,如50 mg/mL+20 mg/mL CS组热处理后离心稳定性仍可达到95%。这可能是因为大豆分离蛋白发生热变性聚集,进一步强化凝胶结构,很好地束缚了结构脂和水分子的分子迁移,避免其从凝胶结构析出。已有研究表明以蛋白为主要乳化剂的HIPE一般具有较好的热稳定性[17]。

图6 大豆分离蛋白与多糖协同稳定的HIPE热处理图Fig.6 Thermal stability of HIPE prepared by SPI and polysaccharides after heat treatment

表2 大豆分离蛋白与多糖制备的HIPE热处理后离心稳定性

2.6 HIPE的冻融稳定性

冷冻是实现食品长时间存放而不变质的常用手段,因此冻融稳定性对乳液食品来说也特别重要。大豆分离蛋白与多糖协同稳定的富含EPA/DHA结构脂HIPE冻融稳定性如图8所示。由图8可知:经过3次冻融循环后,所有HIPE均有不同体积的油相析出,而何青[18]冻融处理肌原纤维蛋白颗粒稳定的橄榄油HIPE并无明显油相析出。这可能是由于富含中链脂肪酸和多不饱和脂肪酸的油脂黏度较低,流动性大,冻融过程中蛋白质发生冷冻变性,破坏了凝胶网络结构,分散的油滴析出和聚集。50 mg/mL SPI溶液单独稳定的HIPE经1次冻融后,便有大量油水析出,3次冻融后稳定性为67.21%;高酯果胶和壳聚糖的加入明显改善了HIPE的冻融稳定性,具有质量浓度正相关性,尤其是壳聚糖效果优于高酯果胶;其中50 mg/mL SPI+20 mg/mL CS组达到了92.41%。主要原因可能是:1) 蛋白和多糖互穿形成三维网络结构,避免冷冻过程中蛋白分子之间和分子内部发生聚集;2) 蛋白与多糖在油水处形成更致密、更厚的界面膜,降低冰晶对界面膜的破坏程度;3) 高酯果胶与壳聚糖都可降低冰晶的结晶速率,减少冰晶数量[19]。

图7 大豆分离蛋白与多糖协同稳定的HIPE冻融循环图Fig.7 Freeze-thaw stability of HIPE prepared by SPI and polysaccharides

表3 大豆分离蛋白与多糖制备的HIPE的冻融稳定性

3 结 论

考察了大豆分离蛋白与高酯果胶(或壳聚糖)复合对富含EPA/DHA结构脂HIPE稳定性的影响。高酯果胶和壳聚糖(尤其后者)可明显提高HIPE体系的乳化稳定性,制备得到高稳定性的HIPE,离心稳定性最高达到了(95±0.38)%,乳液粒径大幅降低,从38.69 μm降低至16.06 μm,弹性模量与黏性模量大幅增强,表现为以弹性为主的凝胶网状结构。HIPE具有较高的热稳定性,达到了(95.06±0.51)%,说明热处理并未影响到乳液结构;冻融过程中由于蛋白质变性,HIPE发生油水析出的现象;其中壳聚糖可改善大豆分离蛋白制备HIPE的冻融稳定性,50 mg/mL SPI+20 mg/mL CS的冻融稳定性为(92.41±0.29)%。综上所述,大豆分离蛋白和壳聚糖可用于制备富含EPA/DHA结构脂的HIPE,这为其在食品加工应用中的可能性提供了研究基础,也证明了蛋白与多糖复合是制备高质量HIPE的有效途径。