昆虫肠道微生物及其功能研究方法进展

马 玲, 曹靖瑜, 白建洋, 徐 喆, 李 璐, 张 月, 闵梦茹

(东北林业大学林学院, 哈尔滨 150006)

昆虫是地球上种类最为丰富、数量最为巨大的节肢动物类群,对人类生产生活有着深远影响(Bassetetal., 2012)。与所有动物类群相似,昆虫体内也栖息着种类各异的微生物,包括细菌、病毒、真菌和原生生物(王四宝和曲爽, 2017)。肠道微生物指栖息在宿主昆虫肠道内所有微生物群落的总称(Rangbergetal., 2012),对宿主昆虫的营养代谢、生理行为、防御解毒等诸多方面产生重要影响(Ankrahetal., 2017; Chengetal., 2017; Zhengetal., 2019)。

近年来,昆虫肠道微生物研究逐渐成为人们关注的热点领域。尽管绝大部分肠道微生物仍无法人工分离而培养(Dillon and Dillon, 2004),但随培养方法改进与多种组学技术联合分析的运用,难以人工培养的微生物也被更多发现与研究。运用肠道微生物来防治农林害虫、促进资源利用与有害物质降解呈现出广阔应用前景。本文将简述昆虫肠道微生物多样性及影响因素、功能应用与传播机制、分离鉴定与研究方法以及无菌昆虫的获得加以总结,以期为肠道微生物理论与应用研究提供参考。

1 昆虫肠道微生物多样性及影响因素

不同种类昆虫肠道结构、肠道内环境不同,肠道微生物数量与种类也存在差异(Cazemieretal., 1997; Colmanetal., 2012)。具有简单、直消化道的昆虫可能拥有微生物群较有复杂消化道结构如盲肠、憩室等的昆虫少(Engel and Moran, 2013)。大多细菌生长最适pH值为6～7,而大部分鳞翅目与双翅目中肠pH值为8～10,一些双翅目幼虫中肠pH值为3,导致不同目昆虫主要肠道微生物种类不同(Clark, 1999)。

昆虫肠道内栖息的微生物大多来自食物与外界环境,不同昆虫个体的肠道微生物受昆虫食性、龄期以及外界环境等因素影响而处于动态变化中(李丹红等, 2017),但主要都属于厚壁菌门(Firmicutes)与变形菌门(Proteobacteria)(Colmanetal., 2012)。以油菜为食的草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda菌群丰度显著高于以野生燕麦为食的个体(Lvetal., 2021);家蚕Bombyxmori在发育早期优势菌属为假单胞菌属Pseudomonas,但在发育后期该菌属丰度显著下降(Chenetal., 2018);病毒侵染后,甜菜夜蛾Spodopteraexigua肠道内的微生物载量会呈现上升趋势(Martínez-Solísetal., 2020)。26～37 ℃变温处理埃及伊蚊Aedesaegypti后,其体内的沃尔巴克氏体Wolbachia无法再正常传代(Rossetal., 2017)。

表1 不同目昆虫的主要肠道微生物组成Table 1 Composition of main gut microbes of different insects

在没有外界环境干扰情况下,肠道微生物会处于相对健康与稳定的状态,但若外界病原物侵染导致宿主肠道菌群失衡,正常存在的共生菌也将转变为病原菌。例如,斯氏按蚊Anophelesstephensi受球孢白僵菌Beauveriabassiana侵染后沙雷氏菌Serratia载量升高,随着感染过程持续沙雷氏菌Serratia转移至血淋巴,导致宿主死亡速度加快(Weietal., 2017)。烟草天蛾Manducasexta感染苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis后,其体内共生菌粪肠球菌Enterococcusfaecalis将协同苏云金芽孢杆菌B.thuringiensis引发宿主快速死亡(Masonetal., 2011)。球孢白僵菌入侵红脂大小蠹Dendroctonusvalens导致其肠道菌欧文氏菌Erwinia丰度上升,打破肠道菌群间平衡加速宿主昆虫的死亡(Xuetal., 2019)。

2 昆虫肠道微生物的功能

肠道微生物多样化对宿主有不同作用。一方面,肠道微生物具有提高宿主食物利用率、合成所需营养物质等重要作用。蜜蜂消化系统中的双歧杆菌Bifidobacterium和吉利安氏菌Gilliamella可以协助宿主代谢花粉中的半纤维素和果胶(Zhengetal., 2019)。斜纹夜蛾Spodopteralitura肠道中肠球菌Enterococcus与假单孢菌Pseudomonas在宿主降解聚合物方面发挥作用(Xiaetal., 2020)。另一方面,肠道微生物与外界环境、宿主昆虫间的相互作用也在多方面展示肠道微生物对宿主行为的影响。比如,桔小实蝇Bactroceradorsalis将共生菌普罗菲登斯菌Providencia和克雷伯氏菌Klebsiella涂抹到蝇卵表面,促进寄主果实生成β-石竹烯,从而间接影响实蝇成虫对产卵地的选择(Lietal., 2020);沙漠蝗Schistocercagregaria的共生菌成团泛生菌Pantoeaagglomerans在粪便中产生挥发性酚类物质,以此引发蝗虫的集群活动(Dillonetal., 2002)。此外,昆虫肠道微生物还在一定程度上赋予了宿主对杀虫剂的耐药性。比如点蜂缘蝽Riptortuspedestris隐窝中的伯克氏菌Burkholderia可帮助宿主降解杀螟硫磷(fenitrothion, MEP)并让宿主获得对MEP的抗性(Itohetal., 2018);肠道微生物还能协助抵御包括病原体在内的非本地菌群的定殖,从而防止宿主肠内感染。像无菌茶长卷蛾Homonamagnanima支持苏云金芽孢杆菌生长量为正常种群的20 倍,宿主正常肠道微生物的存在可帮助昆虫抑制病原菌生长(Takatsuka and Kunimi, 2000)。不同昆虫肠道微生物各有不同,从而导致不同菌群的昆虫对杀虫剂及病原菌抗性各异,与肠道菌群稀少的昆虫相比,菌群庞大的昆虫更有可能形成抗性(Siddiquietal., 2022)。

3 昆虫肠道微生物传播机制

社会性昆虫蜜蜂出房后与成年蜜蜂通过栖息地或媒介生物进行菌群水平传播(Martinsonetal., 2012; 郑林宇等, 2022)。再如桔小实蝇共生菌CitrobacterfreundiiBD(CF-BD)在幼虫与成虫时期通过唾液、食物、排泄物等途径进行水平传播(Guoetal., 2017);而其产卵时成虫可将共生菌CF-BD附着于卵表面,垂直方向将共生菌传播给新孵幼虫。通过序列分析比对,斜纹夜蛾S.litura肠道有益共生菌蒙氏肠球菌Enterococcusmundtii很可能通过卵进行垂直传播(Shaoetal., 2017)。研究表明,约65%昆虫都含有的内共生菌沃尔巴克氏体主要通过卵进行垂直传播(张治军等, 2021)。此外,昆虫发育过程中会经历多次蜕变,每次蜕皮围食膜上的微生物群落都会大部分丧失,但特殊结构例如隐窝的存在,为肠道微生物定殖提供了相对稳定的环境从而促进微生物留存(Dillon and Dillon, 2004)。

4 昆虫肠道微生物的分离鉴定和功能研究方法

4.1 昆虫肠道微生物的分离鉴定方法

肠道微生物研究初期采取传统分离培养的方法,但存在大量微生物难以人工培养、培养过程中菌株有可能富集或衰减的问题(Dillon and Dillon, 2004)。近年,通过改进传统培养技术发展出培养组学——通过利用多种培养条件,以高通量培养的方式培养细菌使得越来越多微生物被分离出来。鉴定分离出微生物的具体种,传统方法如形态学分析、革兰氏染色及生理生化反应等鉴定步骤繁琐,耗时较长,具有一定局限性(闫雯倩等, 2022)。而基于蛋白质检测的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization and time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)可以一定程度上弥补传统鉴定方法的空缺。Tandina等(2016)将培养组学与MALDI-TOF联用,鉴定出了新共生菌——春冈乳球菌Lactococcuschungangensis。传统鉴定方法与新技术的结合不仅提高了鉴定准确度,效率也得到了大大的提升,MALDI-TOF MS还可通过与傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectrometer, FTIR)联用增加了细菌鉴定的广度与准确度(闫雯倩等, 2022)。随着分子生物学发展,微生物检测深入到了分子水平,其中便包括核酸杂交技术、核酸扩增技术、脱氧核糖核酸(DNA)指纹图谱技术、基因芯片技术及高通量测序技术等,难以人工培养微生物的检测也更为便捷。通过二代测序技术检测细菌16S rRNA基因并对可操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs)注释结果分析,可在门、纲、目、科、属、种水平上进一步分析菌群多样性与丰富度(徐昭焕等,2022)。对桑粒肩天牛Aprionagermari肠道细菌进行分子生物学分析,使得季节因素对天牛肠道菌群结构的影响更为清晰(杨云秋等, 2018)。技术的发展提供给我们更多菌群信息,但基于核苷酸的方法仍然存在一定局限性与偏差,像是从不同细菌中提取核苷酸的容易程度就存在差异,最终结果可能与实际情况存在一定偏差(Headetal., 1998)。

4.2 昆虫肠道微生物功能主要研究方法

随着多种组学技术的发展,研究中常将宏基因组学、蛋白质组学、代谢组学等多种技术联合运用,发挥各组学最大优点,使得微生物检测鉴定以及功能推测更为高效、有力。其中,宏基因组学是所有微生物基因组总和,通过基因筛选与测序来分析昆虫肠道菌群的多样性、结构、功能以及进化关系、协作关系等(曹乐和宁康, 2018),其两大关键技术——高通量测序技术与基因芯片技术互补,芯片技术可以解决测序技术深度不足与定量差的缺陷,高通量测序技术克服芯片不易发现新基因的弊端(杨云秋等, 2018),利用该技术研究黑胸散白蚁Reticulitermeschinensis肠道菌群发现其肠道菌中含有许多β-葡萄糖苷酶的基因,证实宿主肠道菌群具有高代谢活性(胡紫媛和夏嫱, 2021);蜜蜂宏基因组发现肠道菌Gilliamellaapicola具有果胶降解酶基因,可帮助宿主打破坚硬的花粉粒多糖壁从而释放单糖(Zhengetal., 2016);蛋白质组学通过比较不同生理条件下蛋白的表达,从而进行蛋白质的分类鉴定以及蛋白间相互作用与功能的研究(Domon and Aebersold, 2006)。利用蛋白组学技术分析,Jing等(2020)发现杨干象甲Cryptorhynchuslapathi肠道菌群拥有合成氨基酸和消化蛋白质等功能;代谢组学通过研究菌群代谢物质的数量、种类及变化规律(Tokarzetal., 2017),为代谢通路与代谢物含量变化提供关键信息(曹乐和宁康, 2018)。通过代谢组学技术,发现蜜蜂肠道微生物可在宿主降解植物次生代谢物质及消化花粉外壁中发挥关键作用(Kešnerováetal., 2017; Tokarzetal., 2017)。多种组学技术手段的联合使用使得越来越多未曾获得人工培养微生物得以发现(朱永官等, 2015)。但对于微生物具体功能验证,仍需进行一系列微生物定向去除与回接试验(王争艳等, 2020)。验证微生物具体功能常用方法有体外试验、微生物补充、菌群移殖、沉默微生物成员相关基因等(Chengetal., 2017; Mottaetal., 2018; Gaoetal., 2021),不同功能研究方法非独立存在,实际应用中多种方法相互穿插使用。

体外试验通过在宿主体外培养微生物并测定其生理生化特性,从而推测在宿主体内该微生物具有的功能,在使用中常与液相色谱-质谱联用技术结合。将CF-BD添加到富含敌百虫的BHI琼脂培养基中,发现CF-BD在培养基上的生长速率和菌圈直径没有差异,表明该菌可能对敌百虫耐受、更可能具有降解敌百虫的能力。结合HPLC-MS分析发现不含CF-BD的富敌百虫培养基纯化出的滤液敌百虫含量高,敌百虫未被降解,而含CF-BD的富敌百虫培养基中的敌百虫被降解为毒性远低于敌百虫的水合氯醛和亚磷酸二甲酯,证明桔小实蝇B.dorsalis体外共生菌CF-BD通过将有机磷类杀虫剂敌百虫转化为毒性较低的物质,从而降低敌百虫对桔小实蝇的毒性(Chengetal., 2017);Ozdal和Algur(2022)通过高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)分析发现辛德勒不动杆菌Acinetobacterschindler菌液可降解约70%的α-硫丹与α-氯氰菊酯。体外试验探究微生物功能,有助于分析体内环境下微生物功能分析。

通过饲喂、注射等手段将特定微生物补充到宿主体内,比较回接前后宿主生理变化来判断该菌与宿主间关系从而判断微生物具体功能:烟草天蛾体内共生菌粪肠球菌E.faecalis注射到无菌烟草天蛾血腔后,该菌将转变为病原菌引发血细胞聚集现象,诱导家蚕先天免疫反应。经苏云金杆菌毒素处理导致宿主肠道穿孔后饲喂无菌家蚕粪肠球菌E.faecalis,将引发宿主如败血症后快速死亡(Masonetal., 2011);在热压处理后无菌食物中添加菌株饲喂黑腹果蝇Drosophilamelanogaster,发现雄性黑腹果蝇间的攻击行为较无菌雄性黑腹果蝇有明显提升,同时发现共生微生物促进宿主果蝇的攻击行为在营养匮乏的情况下无法实现,表明发育早期营养信号与共生微生物协同促进成年黑腹果蝇的攻击行为(Jiaetal., 2021);阿尔维斯诺德格拉斯菌Snodgrassellaalvi可在蜜蜂肠壁形成生物膜,作为抵抗外来病菌入侵的机械屏障。令无菌蜜蜂取食正常蜂的肠匀浆从而将正常蜂肠道菌群移植到无菌蜂肠道内,发现草甘膦处理将干扰正常菌群定殖并改变蜜蜂肠道内有益共生菌阿尔维斯诺德格拉斯菌S.alvi丰度,从而降低肠道微生物对条件病原菌的抵抗作用(Mottaetal., 2018)。

利用分子生物学及遗传改造等技术手段对共生菌进行改造,可有力地验证并展示菌株的功能活性与关键基因。Gao等(2021)使用RNAi技术沉默Toll通路相关基因Rel2,发现Sm-YN3通过激活寄主昆虫Toll通路从而抑制疟原虫Plasmodiumvivax生长;敲除菌株Su-YN1合成Amlip蛋白的相关基因,发现该菌株对疟原虫抑制率显著下降,从而证实该菌株通过合成Amlip从而抑制疟原虫传播。

共生菌体外生化测定能一定程度上帮助我们探究微生物功能,但菌株在体外试验中具有的生理功能在宿主体内不一定存在,因此仍需进行体内功能验证(王争艳等, 2020)。深入探究、验证菌群特定功能不仅能够加深对多物种种间相互作用的理解,对于解析肠道微生物在宿主与外源胁迫中发挥的功能至关重要,昆虫肠道微生物也可作为特殊助剂协助害虫管理。常用的几种微生物体内功能验证方法相辅相成,其共同基础就是无菌昆虫模型构建,但合理高效的无菌模型构建还有目前众多难以克服的问题。

5 无菌昆虫的获得

无菌昆虫模型的构建主要通过高温处理、溶菌酶处理、无菌饲养处理及抗生素处理等方式清除肠道内的微生物群落实现。研究表明,在褐飞虱Nilaparvatalugens卵期,35 ℃处理72 h后可显著降低其共生菌数量(傅强等, 2001)。但高温法局限性较大,只适用于耐高温宿主。溶菌酶可成功去除美洲大蠊Periplanetaamericana共生菌Sulciamuelleri,但该菌去除后将导致其宿主组织发炎并干扰雌成虫的卵巢发育(Douglas, 1989)。除了垂直传播方向的共生菌,大多昆虫卵内无菌,孵化后通过自相残杀、交哺食粪、摄取卵壳等获得肠道菌群(Tayloretal., 2014; Salcedo-Porrasetal., 2020)。全变态昆虫也几乎在无菌状态化蛹,化为成虫后再重新获得菌群(Majumderetal., 2020)。无菌条件下连续饲喂蜜蜂无菌蔗糖糖浆可获得无菌蜜蜂(Mottaetal., 2018);无菌沙漠蝗通过饲喂γ射线处理后的冻干草与麦麸后获得(Dillonetal., 2000)。抗生素法是指通过连续饲喂添加一定比例的某一抗生素或多种抗生素的昆虫食料,显著降低肠道菌群丰度从而达到清除肠道菌群的目的(黄艳红, 2012; 沈金红等, 2018; 王志博等, 2021)。由于抗生素处理法操作简便对宿主影响较小并且无菌状态相对稳定,成为一种应用相对广泛的肠道菌群清除手段。

比如,使用100 μg /mL庆大霉素与利福平混合液(胡紫媛和夏嫱, 2021)或200和500 μg/mL庆大霉素饲喂德国小蠊Blattellagermanica(傅强等, 2001),其共生菌去除率均可达100%。25 μg/mL利福平处理褐飞虱5 d后可去除99%以上的沃尔巴克氏体Wolbachia(李国勇等, 2017);灰茶尺蛾Ectropisgrisescens连续2个世代取食质量分数为2.5 mg/mL利福平和四环素后可去除沃尔巴克氏体(Dillonetal., 2002)。尽管抗生素法获无菌昆虫在实际应用中较为便捷与广泛,但由于抗生素对昆虫具一定毒性,影响昆虫的生理特性以及生殖能力,仍存在一定局限性。

一方面,抗生素处理在一定程度上会影响宿主生长发育,干扰宿主营养代谢,削弱宿主免疫抗性,譬如Duan等(2021)用1/50(v/w)链霉素和青霉素联合处理蜜蜂后削弱了宿主营养代谢功能,甚至直接干扰了蜜蜂免疫功能;另一方面,抗生素处理对昆虫还会有跨代影响,Ourry等(2020)研究发现,0.5 mg/mL四环素处理甘蓝地种蝇Deliaradicum整个成虫期,在其后代肠道菌群中也发现了细菌菌群多样性下降的现象。值得注意的是抗生素联合使用也可能无法完全去除某一类菌,更多的只是抑制菌群生长。并且共生菌完全去除效果具有暂时性,停用抗生素后菌群数量不会一直维持在较低的状态,而会随着抗生素的停用逐渐恢复菌群,但无法恢复到正常菌群的状态。德国小蠊共生菌在左氧氟沙星和庆大霉素处理后丰度显著降低,停止抗生素处理14 d其肠道菌群开始恢复,但也无法完全恢复到处理前水平(Lietal., 2020)。因此,在选择有效抗生素配方的同时,还需减少抗生素对宿主的毒副作用,避免影响实验结果的可信度。

6 昆虫肠道微生物的应用

经过长期协同进化,昆虫肠道微生物与宿主形成了紧密的共生关系。肠道共生菌对于宿主的重要意义被广泛认知,通过有益微生物进行生物防治成为控制有害生物增长的重要手段:通过利用沃尔巴克氏体的杀雄能力(刘媛等, 2021)与其诱导孤雌生殖的特性,将其转接到害虫天敌体内诱导天敌增殖来控制害虫种群数量(Bianetal., 2013)。随着遗传技术手段的进步,通过遗传手段改良和操纵昆虫肠道共生菌也成为了生物防治的新突破点。肠道微生物还可作为dsRNA传递的载体,实现RNA干扰的可持续性与物种特异性传递(Whitten and Dyson, 2017)。使用RNAi技术抑制锥蝽Rhodniusprolixus体内可稳定定殖与传代的共生菌蝽象红球菌Rhodococcusrhodnii卵黄蛋白原基因表达,能成功降低锥蝽幼虫存活率与卵孵化率(张振宇等, 2017)。昆虫肠道共生菌研究与其他学科的融合发展也取得了进展,通过改造昆虫共生菌为基因表达载体,可实现转基因效果从而防治有害生物与虫媒传染病(王四宝和曲爽, 2017; Caragataetal., 2021; 蒋永茂等, 2022)。

在研究共生菌组成与功能的基础上,运用共生菌提高昆虫资源开发与运用的前景也十分可观。比如我国重要的经济昆虫——家蚕,其肠道菌Stenotrophomonasmaltophilia能为宿主提供必需氨基酸,并促进家蚕的生长发育(陈勃生, 2020)。维持生态平衡与创造经济收益的重要昆虫——蜜蜂,其肠道共生菌双歧杆菌属Bifidobacterium与吉利安氏菌Gilliamella可帮助宿主吸收短链脂肪酸,提高宿主食物利用率(Zhengetal., 2019)。

不仅于此,运用微生物进行生物能源生产与有害物质降解近来也是微生物研究一大热点。以木质纤维素为食的暗黑鳃金龟Holotrichiaparallela,其肠道中含有丰富的可降解木质纤维素的菌株(黄胜威, 2012),或许可用于全新生物质能转化反应器的构建(Shengetal., 2012)。黑水虻Hermetiaillucens幼虫对抗生素的生物降解能力与其肠道共生菌呈现相关性(刘存成, 2020)。在环境保护方面,黄粉虫Tenebriomolitor共生真菌Trameteshirsuta对聚乳酸(polylactic acid, PLA)塑料具有一定的降解能力(冯娟等, 2022),大蜡螟Galleriamellonella具有取食与降解塑料能力,其他相关有益共生菌的研究与利用也逐渐进入人们视野(郭鸿钦等, 2020; Ibrahimetal., 2021)。由此看出,通过清除肠道共生菌这一技术手段探究与验证菌群功能,还将促进农林、生态、能源等多个学科领域的共同发展。

7 小结与展望

本文综述了肠道微生物多样性及影响因素、功能与应用、传播机制、分离鉴定与研究方法、无菌昆虫获得方法。肠道共生菌对宿主昆虫的营养代谢、生长发育等诸多方面具有重要影响。在长期协同进化过程中,宿主昆虫形成了一套健全的免疫系统来保留有益共生菌、杀灭外来病原菌,从而维护肠道微生物间的平衡与稳定。但目前绝大多数昆虫肠道微生物潜在功能及与宿主互作的分子机制尚未揭晓,共生菌对于宿主生命活动的具体功能也所知甚少,这些将成为未来研究的重点和热点。深入挖掘微生物分泌物与代谢物、菌群生态位、微生物分解代谢等对宿主昆虫营养代谢、生理行为、防御解毒的作用或有助于未来昆虫肠道微生物运用于有害生物防治、环境垃圾治理、食品加工中。

已发展的微生物研究方法大多以分子生物学为基础,该方法仍有不可忽视的缺陷:在检测中将破坏微生物结构,并在原位状态低丰度微生物检测及微生物体内细胞表型异质性下的研究局限较大。拉曼光谱作为一种能反映微生物单细胞表型分子组成的光学检测方法,将来或可运用于微生物种类鉴定、细菌代谢产物检测、抗生素药敏试验中。但当前拉曼光谱数据库有限、设备价格较高、操作难度较大,在微生物研究的推广中还有较大发展空间(刘坤香, 2023),或在不久的将来,该技术也将与现有研究技术结合,丰富昆虫肠道共生菌研究。随着气候条件与人口不断变化,探索肠道共生菌作为管理宿主或用于协调已有害虫的防治将促进更有效的创新技术发展,并为寻找便捷、高效的生物防治方法提供新思路。无菌昆虫模型的构建有助于对昆虫肠道微生物在宿主与外源胁迫相互作用过程中扮演角色的认知,但当前获取无菌昆虫的方法仍有一定局限性,相信随着共生菌功能研究技术的不断进步,肠道微生物功能研究方法也将更为全面与科学。

总之,肠道微生物的生物学功能及其作用机制复杂多样,目前已知的微生物功能机制仍只是冰山一角,潜在资源仍等待我们进一步地挖掘与运用。深入解析肠道微生物功能,不仅可为揭示昆虫-微生物的互作机制奠定基础,更有助于寻找更为环保、高效的有害生物控制方法。