宫颈脱落细胞miR-218-5p和FOXP3的表达与宫颈病变及HPV感染状态的关系

王振威 刘燕 段宁娟

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率位居第二位,并呈现逐渐增加和年轻的趋势[1]。人乳头状瘤病毒(HPV)感染后,可能导致宫颈病变,最终诱发宫颈癌,甚至通过分娩感染下一代,大多数HPV能被免疫系统清除,但某些基因型的持续性HPV感染会导致宫颈癌[2]。国际癌症研究机构(IARC)将12种HPV基因型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59)归类为宫颈癌的病原体,另外8种(26、53、66、67、68、70、73和82)归类为宫颈癌的可能病因[3]。宫颈上皮内瘤变(CIN)的早期发现、早期治疗以及提高其筛查准确性,对宫颈癌的防治尤为重要。miRNA失调与多种人类恶性肿瘤有关,如乳腺癌、肺癌、结肠癌和宫颈癌[4]。研究表明,在宫颈癌组织中,miR-218-5p的表达和正常组织相比显著降低[5]。叉头蛋白 3 (FOXP3)在预防自身免疫和维持免疫稳定性方面起着不可或缺的作用,FOXP3表达失调和FOXP3功能的改变会影响宿主的免疫稳态,导致自身免疫性疾病和肿瘤发生[6]。FOXP3是一种特异性转录因子,在调节性T细胞(Tregs)表面表达,在肿瘤微环境中起重要作用,并参与乳腺癌、胃癌、甲状腺癌和非小细胞肺癌的肿瘤细胞生长、侵袭和转移[7]。FOXP3在宫颈癌中高表达,能够促进癌细胞增殖和侵袭,导致宫颈癌的发生发展和转移[8]。本次研究旨在探讨宫颈脱落细胞miR-218-5p和FOXP3的表达与宫颈病变及HPV感染状态的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年2月至2022年2月我院妇产科收治的98例慢性宫颈炎患者即为慢性宫颈炎患者组,年龄27～50岁,平均(36.50±4.56)岁;体质指数(BMI)为(23.24±3.41)kg/m2;宫颈上皮内瘤变(CIN)患者92例作为CIN组,年龄25～50岁,平均(37.00±4.85)岁;BMI(23.28±3.48)kg/m2,其中CINⅠ级45例为CINⅠ组,CINⅡ级25例为CINⅡ组,CINⅢ级22例为CINⅢ组;宫颈鳞癌患者88例为宫颈鳞癌组,年龄25～49岁,平均(36.25±4.23)岁;BMI(23.35±3.55)kg/m2。本次研究本院伦理委员会已批准,所有患者都自愿参加。3组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 纳入与排除标准 (1)纳入标准:宫颈上皮内瘤变和宫颈鳞癌患者均经过病理确诊,符合《宫颈癌及癌前病变规范化诊疗指南(试行)》诊断标准[9]。(2)排除标准:①手术前接受过物理或化学治疗的患者,如放疗、免疫治疗和化疗;②处于妊娠期或哺乳期的患者;③患有其他自身免疫性疾病的患者;④合并其他恶性肿瘤的患者。

1.3 方法

1.3.1 宫颈脱落细胞miR-218-5p的表达水平:均在生理期结束后清晨,将细胞采集刷插入宫颈外口,以子宫颈外为中心均匀的旋转5周,取出宫颈刷放置于细胞保存液中。使用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)提取样本总RNA。采用逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,按照miScript SYBR®Green qPCR Kit试剂盒说明书行qRT-PCR反应,qRT-PCR反应:96℃ 10 min、94℃ 10 s、57℃ 30 s,共45个循环,miR-218-5p内参为U6,其相对表达量采用2-ΔΔct计算。见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2 宫颈脱落细胞FOXP3表达水平、炎性因子水平以及HPV感染:取1 ml的细胞液提取DNA,采用PCR及导流杂交法检测HPV感染,试剂及仪器购自于潮州凯普生物化学有限公司。之后采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(北京雅安达生物技术有限公司)检测FOXP3、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-10(IL-10)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)-α表达水平。酶标仪购自深圳市健竹科技有限公司。

2 结果

2.1 miR-218-5p和FOXP3在3组中的表达水平比较以及HPV感染情况 慢性宫颈炎患者组、CIN组、宫颈鳞癌组miR-218-5p水平依次显著降低,FOXP3水平依次显著升高,HPV感染率依次增加,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 miR-218-5p和FOXP3在3组中的表达水平比较以及HPV感染情况

2.2 不同CIN程度下miR-218-5p和FOXP3表达水平比较 CINⅢ组miR-218-5p的表达水平显著低于CINⅡ组及CINⅠ组,CINⅡ组显著低于CINⅠ组;CINⅢ组FOXP3的表达水平显著高于CINⅡ组及CINⅠ组,CINⅡ组显著高于CINⅠ组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同CIN程度下miR-218-5p和FOXP3表达水平比较

2.3 miR-218-5p和FOXP3水平相关性 Pearson相关性分析结果显示,CIN组和宫颈鳞癌组患者miR-218-5p和FOXP3呈负相关(r=-0.361,P<0.001)。见图1。

图1 miR-218-5p和FOXP3水平相关性

2.4 3组炎性因子水平比较 CINⅢ组IL-2的表达水平显著低于CINⅡ组及CINⅠ组,CINⅡ组显著低于CINⅠ组(P<0.05);CINⅢ组IL-10、TNF-α的表达水平显著高于CINⅡ组及CINⅠ组,CINⅡ组显著高于CINⅠ组(P<0.05)。IFN-γ表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 3组炎性因子水平比较 pg/mL,

2.5 miR-218-5p和FOXP3与炎性因子水平的相关性 Pearson相关性分析显示,CIN组患者宫颈脱落细胞中miR-218-5p的表达水平与IL-2水平呈正相关,与IL-10、TNF-α水平呈负相关(P<0.05);FOXP3的表达水平与IL-2水平呈负相关关系,与IL-10、TNF-α水平呈正相关(P<0.05)。见表5。

表5 miR-218-5p和FOXP3与炎症因子水平的相关性

2.6 宫颈脱落细胞miR-218-5p和FOXP3的表达与HPV感染的相关性 以CIN组以及宫颈鳞癌组所有患者miR-218-5p 和FOXP3表达水平的平均值为界限。即<0.60(n=94)为低表达,≥0.60(n=86)为高表达和<35.81 ng/mL(n=88)为低表达,≥35.81 ng/mL(n=92)为高表达。结果显示,宫颈脱落细胞中miR-218-5p表达水平与CIN组以及宫颈鳞癌组患者HPV感染呈负相关(P<0.05),FOXP3表达水平与CIN组以及宫颈鳞癌组患者HPV感染呈正相关(P<0.05)。见表6。

表6 宫颈脱落细胞miR-218-5p和FOXP3的表达与HPV感染相关性 例

3 讨论

宫颈癌是全球女性第四大常见恶性肿瘤, 99%的宫颈癌病例是由HPV的持续性感染引起的,相关研究证实, HPV可显著增加宫颈癌的发病率[10]。当HPV持续感染宫颈区域,侵入黏膜鳞状上皮细胞,由CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ逐渐发展为病变,最终癌细胞会突破基底膜,发展为浸润性宫颈癌[11]。因此寻找与宫颈病变有关的生物标志物具有重要意义。

miR-128-3p在各种类型的癌症中异常表达,与促进或抑制肿瘤进展有关[12]。在宫颈癌细胞系中,已经发现miR-218-5p调节癌基因的表达,有助于调节细胞凋亡,参与调节细胞侵袭[13]。miR-128-3p通过抑制磷酸肌醇-3-激酶调节亚基1来抑制肝癌细胞增殖[14]。本研究表明miR-128-3p对宫颈病变的进展表现出抑制作用。

Treg能抑制机体的免疫反应,使机体对肿瘤细胞免疫耐受, Treg细胞主要表达Foxp3蛋白,Foxp3与某些肿瘤中CD4+CD25+Treg细胞的活化有关,以此影响肿瘤的增殖[15]。FOXP3 细胞通常被认为可抑制几种癌症的抗肿瘤免疫应答,如胃肠道癌和胆囊癌[16]。FOXP3过表达导致严重的免疫缺陷,FOXP3在癌症患者的肿瘤浸润组织和外周血中含量丰富,通常与预后不良有关[17]。重要的是,FOXP3在宫颈癌的淋巴血管生成中起重要作用,在正常组织中,其参与局部免疫反应,但在局部肿瘤微环境中过表达时,其有助于肿瘤细胞逃避免疫系统监视并促进肿瘤生长[18]。本次研究表明,表明FOXP3与宫颈病变具有一定的联系,并随着病变的发展,FOXP3水平提高。

Pearson相关性分析结果显示,CIN组患者miR-218-5p和FOXP3表达呈负相关(P<0.05),表明二者共同参与宫颈病变的发生。随着CIN程度的加深,IL-2表达水平显著降低,IL-10、TNF-α的表达水平显著升高,且miR-218-5p的表达水平与IL-2水平呈正相关(P<0.05),与IL-10、TNF-α水平呈负相关(P<0.05);FOXP3的表达水平与IL-2水平呈负相关(P<0.05),与IL-10、TNF-α水平呈正相关(P<0.05),表明miR-218-5p和FOXP3与炎性因子相关,进一步表明其可以作为宫颈病变的预警之一。本次研究中,慢性宫颈炎患者组、CIN组、宫颈鳞癌组HPV感染率依次增加,并且宫颈脱落细胞中miR-218-5p表达水平与CIN组以及宫颈磷癌组患者HPV感染呈负相关(P<0.05),FOXP3表达水平与CIN组以及宫颈鳞癌组患者HPV感染呈正相关(P<0.05),提示HPV感染与宫颈病变有关,而miR-218-5p和FOXP3与HPV感染有关。

综上所述,miR-218-5p在CIN和宫颈鳞癌患者宫颈脱落细胞中呈低表达,FOXP3呈高表达,二者呈负相关,二者均与HPV感染有关,有望成为潜在的宫颈病变生物标志物。