TIMP4表达与心房颤动患者心肌纤维化的相关性研究

王传慧 宋帅 潘扬

心房颤动是临床实践中最常见的心律失常,与死亡、卒中和外周栓塞等风险增加密切相关[1]。心房颤动发病率随年龄增长而增加,因此,在全球人口老龄化和慢性病生存率不断加重形式下,心房颤动的发病率呈不断上升趋势[2]。心房颤动的特征是结构和电重塑,心房纤维化是心房结构重塑的标志[3]。心肌纤维化是慢性心肌疾病常见的最终途径,与心房颤动的复发、耐药和并发症相关[4]。纤维化的发展是一个高度复杂,多因素和患者特异性的过程,涉及复杂的神经体液,细胞和分子相互作用[3]。基质金属蛋白酶抑制剂家族(TIMPs)主要包括TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4四个成员,广泛存在于人体所有组织的细胞外基质中,参与细胞外基质的降解和组成,且参与疾病的病理过程[5]。大量研究表明,MMP/TIMP的平衡与心脏病的发生、进展和预后密切相关[6]。TIMP可以通过抑制MMP依赖性细胞外基质蛋白水解来调节细胞外基质的蛋白水解[5]。TIMP4是目前研究最少的TIMPs成员,其在大脑和心脏中呈高表达。既往研究表明,TIMP4影响脂质代谢和平滑肌细胞增殖,下调TIMP4会促进腹主动脉中的动脉粥样硬化斑块沉积[7]。而心肌纤维化是心脏内细胞外基质(ECM)沉积和降解不平衡的过程,导致成纤维细胞过度增殖和心组织间质间隙内细胞外基质蛋白的积聚[8]。故推测TIMP4与心房颤动患者心肌纤维化过程具有一定相关性,本研究分析TIMP4与心房颤动患者心肌纤维化的相关性,以为心房颤动患者的临床诊疗提供一定依据,报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2021年6月至2022年12月在院就诊治疗的82例心房颤动患者为研究对象,根据患者临床情况将其分为阵发性房颤组(n=42)和持续性房颤组(n=40)。阵发性房颤组中,男21例,女21例;年龄37～83岁,平均年龄(45.28±4.73)岁。持续性房颤组中,男22例,女18例;年龄39～84岁,平均年龄(46.13±5.15)岁。另选取同期体检健康者40例作为对照组,男20例,女20例;年龄37～81岁,平均年龄(44.94±4.29)岁。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准:①经临床诊断确诊为心房颤动患者[9];②患者及家属知情且同意;③阵发性房颤患者为房颤发作7 d内可自动终止者,持续性房颤患者为房颤发作持续超过7 d或需电复律律转者;④临床资料完整。

1.2.2 排除标准:①高血压、冠心病以及肾功能不全患者;②心力衰竭患者;③具有心脏病手术史者。

1.3 方法

1.3.1 一般资料收集:收集研究对象性别、年龄、体质指数、左心房内径、左心室内径、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-21(IL-21)相关临床资料。

1.3.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定血清TIMP4和PⅠCP、PⅢCP水平:收集心房颤动患者就诊当日和对照组体检当日静脉血3 ml,4℃冰箱保存,多功能台式离心机(德国Eppendorf,型号:5804/5804 R)4 000 r/min离心10 min,取上清液,-80℃冰箱保存备用。采用血清/血浆总RNA提取试剂盒(上海信裕生物,货号:XYB0901)提取样品总RNA,通过凝胶电泳检验所提取RNA质量,结果显示28S和18S两条RNA带,表明所得RNA产物无DNA污染和RNA降解,可进行下一步实验。使用核酸蛋白分析仪(日本岛津,型号:MultiNA)测定RNA产物浓度和吸光度值,D260/D280比值在1.9～2.1表明RNA纯度较高、质量较好,可进行下一步实验。采用探针法qRT-PCR试剂盒HiScript Ⅱ One Step qRT-PCR Probe Kit试剂盒(南京诺唯赞公司,货号:Q222-01)进行qRT-PCR检测TIMP4 mRNA水平,以GAPDH为内参基因,每个样品设置3个技术重复。qRT-PCR反应体系:2 × One-Step Q Probe Mix 10 μl,One-Step Q Probe Enzyme Mix 1 μl,上游引物0.5 μl,下游引物0.5 μl,TaqMan Probe 0.2 μl,模板RNA 10 ng,50 × ROX Reference Dye 10.4 μl,RNase free ddH2O to 20 μl。qRT-PCR反应程序:①50℃ 30 min,②95℃ 5 min,③95℃ 10 s,60℃ 30 s,45 cycs,④确定Real Time PCR的扩增曲线,制作标准曲线。使用primer5.0软件设计TIMP4和GAPDH的qRT-PCR反应引物,由北京擎科生物公司合成。TIMP4上游引物:5’-CTAGAAACCAACAGTCAGAAGC-3’,TIMP4下游引物:5’-GTTCTGGTGGTAGTGATGATTC-3’;GAPDH上游引物:5’-GAAGAGAGAGACCCTCACGCTG-3’,GAPDH下游引物:5’-ACTGTGAGGAGGGGAGATTCAGT-3’。

1.3.3 血清Ⅰ型前胶原羧基端肽(PⅠCP)、Ⅲ型前胶原羧基端肽(PⅢCP)表达水平测定:根据人PⅠCPELISA试剂盒(武汉华美生物,货号:CSB-E08079h)、人PⅢCP ELISA试剂盒(武汉纯度生物,货号:CD-103108-ELA)说明书配制PⅠCP、PⅢCP的标准品溶液,解冻血清样本,多功能酶标仪(德国BMG,型号:CLARIOstar Plus)测定PⅠCP、PⅢCP标准品溶液及血清样本在450 nm处的吸光度,绘制PⅠCP、PⅢCP标准品回归曲线。根据PⅠCP、PⅢCP的标准品回归曲线方程,计算血清PⅠCP、PⅢCP浓度水平。

2 结果

2.1 3组一般资料比较 对照组、阵发性房颤组、持续性房颤组的TNF-α和IL-21水平呈逐渐升高趋势(P<0.05);3组间性别比、年龄、体重指数、左心房内径、左心室内径差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组间一般资料比较

2.2 3组血清TIMP4和心肌纤维化指标PⅠCP、PⅢCP水平比较 与对照组和阵发性房颤组比较,持续性房颤组血清TIMP4水平显著降低,血清PⅠCP、PⅢCP水平显著升高(P<0.05);与对照组比较,阵发性房颤组血清TIMP4水平显著降低,血清PⅠCP、PⅢCP水平显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 3组血清TIMP4、PⅠCP、PⅢCP水平比较

2.3 血清TIMP4水平与心肌纤维化指标PⅠCP、PⅢCP相关性分析 心房颤动患者血清TIMP4水平与心肌纤维化指标PⅠCP、PⅢCP均呈负相关(r=-0.513、-0.576,P<0.05)。见图1、2。

图1 TIMP4水平与心肌纤维化指标PⅠCP相关性分析图

图2 TIMP4水平与心肌纤维化指标PⅢCP相关性分析图

2.4 多因素logistic回归分析发生持续性心房颤动的影响因素 以心房颤动患者是否发生持续性心房颤动(是=1,否=0)为因变量,以血清TIMP4、PⅠCP、PⅢCP、TNF-α、IL-21水平作为自变量进行多因素Logistic回归分析。结果显示,高水平TIMP4为患者发生持续性心房颤动的独立保护因素(P<0.05);高水平PⅠCP、PⅢCP、TNF-α均为患者发生持续性心房颤动的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 多因素logistic回归分析发生持续性心房颤动的影响因素

3 讨论

心房颤动因为许多患者无症状或症状稍纵即逝,难以记录心律失常,导致诊断具有一定难度[10]。心肌纤维化是一个复杂的多因素和患者特异性过程,是心房颤动发生和复发的关键因素,涉及心房颤动的发生和维持,分为间质纤维化和替代纤维化[3, 4, 11]。最新报告表明,心脏纤维化存在性别差异,胶原蛋白Ⅲ在女性心脏中占主导地位,但在男性心脏中以胶原蛋白Ⅰ为主[8, 12]。研究显示,IL-21是调节压力负荷诱导的心肌重塑的关键物质,抑制IL-21的表达可以通过调节TIMP-4/MMP-9信号通路和心脏修复来提高压力负荷后的炎症消退,进而改善应激超负荷诱导的小鼠心脏肥大和纤维化[13]。TNF-α水平升高与持续性心房颤动发病及术后复发相关[14]。代菁等[15]研究显示,炎性反应可导致心房颤动和心肌纤维化。韩霜等[16]研究显示,心力衰竭与心房颤动间相互作用与促进,因此炎性因子水平可间接反应心房颤动严重程度。本研究发现,心房颤动患者血清TNF-α、IL-21水平均显著上调,且高水平TNF-α为发生持续性心房颤动的独立危险因素,提示炎性因子TNF-α和IL-21会加重心房颤动患者心肌纤维化,导致其病情加重。

大量研究显示,TIMPs在心房颤动患者心肌纤维化过程中的作用至关重要。过往研究表明,TIMP-1水平在心房颤动患者中显著增加,血清TIMP-1水平与心房颤动的进展有关[17]。TIMP2可能介导其抗纤维化作用,含有TIMP2的外泌体可以抑制心脏成纤维细胞的增殖和活化[18]。缺乏TIMP3在不同的动物模型中对心脏纤维化有不同的作用[11]。最新研究显示,在心房颤动小鼠模型中TIMP4显著下调,通过抑制TIMP4可促进心房颤动中的心肌纤维化[19, 20]。本研究发现,心房颤动患者血清TIMP4水平显著下调,且TIMP4与心肌纤维化指标PⅠCP、PⅢCP水平呈负相关,提示TIMP4水平下调会导致心房颤动患者心肌纤维化程度加重,与Li[19]和Ye等[20]研究结果一致。进一步研究发现,高水平TIMP4为发生持续性心房颤动的独立保护因素,高水平PⅠCP、PⅢCP均为患者发生持续性心房颤动的独立危险因素,提示TIMP4在心房颤动疾病的进展中起着至关重要的作用,可能是未来治疗心脏病的良好靶标。

综上所述,心房颤动患者血清TIMP4表达水平显著降低,与患者心肌纤维化程度呈负相关,高水平TIMP4为发生持续性心房颤动独立保护因素。本研究未明确TIMP4参与心房颤动患者心肌纤维化的具体调控途径,下一步可进行动物模型实验对此进行深入研究。