理冲汤对性激素诱导的子宫肌瘤大鼠Wnt/β-catenin 信号通路的调节作用研究*

陈莹莹，刘超萍△，陈 杨

1 湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2 湖南中医药大学基础医学院，湖南 长沙 410208

子宫肌瘤是常见的妇科疾病之一，主要由增生的子宫平滑肌组织和少量的纤维结缔组织形成，又称为纤维肌瘤、子宫纤维瘤［1］。Wnt/β-catenin信号通路的调节异常与多种肿瘤疾病的发生、发展密切相关。近年来研究表明，Wnt/β-catenin信号通路及相关蛋白的异常表达在子宫肌瘤的发病机制中起着重要作用［2］。理冲汤由黄芪、党参等多种中药组成，是治疗妇科疾病的常用中药汤剂之一。有文献报道，理冲汤用于子宫肌瘤患者的临床治疗疗效显著［3-4］，但其药理作用机制尚不明确。笔者通过研究理冲汤对性激素诱导的子宫肌瘤大鼠的药理作用及对Wnt/β-catenin 信号通路的调节作用，为理冲汤的药理作用研究及临床应用提供新的参考和依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康雌性SD 大鼠60 只，SPF 级，2～3 月龄，体质量（220±20）g，购自湖南中医药大学动物实验中心，实验动物合格证号：SYXK（湘）2019-0009。饲养条件：自由进食、饮水饲养于实验动物房。动物实验遵守实验动物福利伦理审查指南。

1.2 药物与试剂理冲汤（生黄芪9 g，党参6 g，白术6 g，生山药15 g，天花粉12 g，知母12 g，三棱9 g，莪术9 g，生鸡内金9 g 组成）由药材饮片制成每毫升含1.7 g生药的制剂，购自于北京同仁堂股份有限公司；苯甲酸雌二醇注射液（天津金耀药业有限公司，批号：20190816）；孕酮注射液（浙江仙琚制药股份有限公司，批号：20191011）；米非司酮胶囊wnt7a（批号：AF8361）、β-Catenin（批号：AF1189）、兔单克隆抗体、山羊抗兔二抗（批号：A0208）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（批号：P0012）均购自碧云天生物技术有限公司；RNA 提取试剂盒（Promega 公司，批号：Z3351）；ECL显色液（Thermo公司，批号：32132X3）。

1.3 实验仪器MB-530 型酶标仪（济南好来宝医疗器材有限公司）；DYCZ-25D 型双垂直电泳仪（北京六一仪器有限公司）；DYCZ-40G 型转印电泳仪（北京六一仪器有限公司）；Gel Doc XR型凝胶成像仪（伯乐生命医学产品有限公司）；FC5718 230V型离心机［奥豪斯国际贸易（上海）有限公司］。

1.4 实验方法

1.4.1 模型建立 除15 只大鼠作为对照组外，其余45 只大鼠参照文献［5-6］方法建立子宫肌瘤大鼠模型，具体方法为：按照0.5 mg/kg 的剂量给予大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液，每日1 次，连续30 天，期间每周腹腔注射1 次孕酮注射液（4 mg/kg），最后5 天同时给予大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇及孕酮注射液，以大鼠血清雌二醇及孕酮水平显著升高及大鼠子宫发生明显病理学变化视为造模成功。

1.4.2 分组及给药 将造模完成后的45 只大鼠按照随机数字表法随机分为3 组，分别为模型组、理冲汤组及阳性对照组，每组15 只。理冲汤组大鼠按照4.5 mL/kg的剂量灌胃给予理冲汤［7］，阳性对照组大鼠按照2.25 mg/kg 的剂量灌胃给予大鼠米非司酮［7］，对照组及模型组大鼠灌胃给予等量生理盐水，每日1次，连续给药28天［7］。

1.5 观察指标

1.5.1 大鼠血清雌二醇及孕酮水平的测定 每组取6 只大鼠，通过眼眶后静脉丛取血至干净离心管中，于4 ℃静置4 h后置于离心机中，离心半径：13 cm，3500 r/mim，离心10 min，取上清液，用全自动生化分析仪测定大鼠血清雌二醇及孕酮水平。

1.5.2 大鼠子宫系数的测定 颈椎脱臼法处死大鼠后，称定大鼠质量，记为W1，分离大鼠子宫称定质量，记为W2，计算大鼠子宫系数。大鼠子宫系数（%）=W2/W1×100%。

1.5.3 大鼠子宫组织病理学检查 处死大鼠后分离子宫组织，在10%中性甲醛中固定24 h 后转移至75%的酒精中，经自动组织脱水机脱水、透明处理，在石蜡包埋机中浸蜡、包埋，进行5 μm 切片，水浴展开，捞片，沥干，放恒温箱中烘干，置于烘箱中烤2 h，常规苏木精-伊红染色（Hematoxylineosin staining，HE），在显微镜下进行组织病理学观察。

1.5.4 大鼠子宫病理学评分及子宫平滑肌厚度的测定 每张标本随机选取3 个视野，测量大鼠子宫平滑肌厚度并参照文献方法［8-9］进行组织病理分级，计算平均病理学评分。0 级：子宫平滑肌细胞排列均匀规则，结构清晰，呈流水样排列，细胞大小适中，未见子宫肌纤维增生肥大、肌纤维排列紊乱和肌纤维穿插现象，内膜腺体形态规则，圆形或椭圆形，腺体上皮细胞均为单层立方或柱状，记0 分。Ⅰ级：平滑肌层少许增厚或不增厚，内环肌和外纵肌排列规则，细胞有增生肥大、变短的现象，部分肌细胞纵横交错，肌纤维排列紊乱，呈轻微编织状，出现穿插现象。腺体上皮细胞呈单层，记1 分。Ⅱ级：平滑肌层明显增厚，大面积平滑肌出现穿插现象，细胞进一步增生肥大，腺体上皮细胞呈现单层或复层立方状或柱状，记2 分。Ⅲ级：平滑肌层明显增厚，平滑肌细胞排列紊乱，穿插现象明显，肌层成漩涡状，记3分。

1.5.5 大鼠子宫wnt7a及β-catenin mRNA水平的测定 取大鼠部分子宫组织，采用RNA提取试剂盒分别提取各组大鼠子宫组织的总RNA。将提取的总RNA逆转录成cDNA后，荧光实时定量PCR检测各组大鼠子宫组织中GAPDH、wnt7a、β-catenin mRNA的表达。各检测基因的实时定量PCR引物见表1，实时定量PCR 结果采用2-△△Ct法计算相对表达量。

表1 引物序列表

1.5.6 大鼠子宫wnt7a及β-catenin蛋白水平的测定 取大鼠子宫组织，放入玻璃匀浆器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解，4 ℃离心留取上清液，向其中加入SDS loading buffer，混匀后放入100 ℃水浴5 min，采用BCA法测定蛋白浓度，处理好待测样品后，取蛋白50 μg进行SDS-PAGE 电泳分离、转膜，将分离的蛋白电转移至PVDF膜上。封闭液室温封闭1 h，经wnt7a、β-catenin 及GAPDH 抗体（1∶1000）孵育后，4 ℃过夜。PBST 充分洗膜后，加入二抗（1∶2000）室温孵育1 h，PBST 清洗后显色液显影，利用凝胶成像仪成像后，应用Image J 软件进行免疫印迹灰度值定量分析。

1.6 统计学方法应用SPSS 19.0 软件对数据进行统计分析及Graphpad prism 8 进行作图，计量资料用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血清雌二醇及孕酮水平与对照组比较，模型组大鼠血清雌二醇及孕酮水平显著升高（P＜0.05），与模型组比较，理冲汤组及阳性对照组大鼠血清雌二醇及孕酮水平显著降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清雌二醇、孕酮水平、wnt7a及β-catenin mRNA水平（±s）

表2 各组大鼠血清雌二醇、孕酮水平、wnt7a及β-catenin mRNA水平（±s）

注：*表示与对照组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05

组别对照组模型组理冲汤组阳性对照组β-catenin mRNA 0.97±0.27 3.71±0.75*1.01±0.39#1.14±0.61*#鼠数15 15 15 15雌二醇（ng/L）25.47±1.37 51.63±1.43*28.18±2.31#26.84±1.01#孕酮/（pmol/L）119.37±3.06 233.67±3.78*147.41±2.73*#128.29±3.66*#wnt7a mRNA 3.35±0.62 1.44±0.55*3.13±0.75*#2.81±0.49*#

2.2 大鼠子宫wnt7a及β-catenin mRNA水平与对照组比较，模型组大鼠子宫wnt7a mRNA 水平显著降低（P＜0.05），β-catenin mRNA 水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，理冲汤组及阳性对照组大鼠子宫wnt7a mRNA水平显著升高（P＜0.05），β-catenin mRNA水平显著降低（P＜0.05）。见表2。

2.3 大鼠子宫wnt7a及β-catenin蛋白水平与对照组比较，模型组大鼠子宫wnt7a 蛋白水平显著降低（P＜0.05），β-catenin 蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，理冲汤组及阳性对照组大鼠子宫wnt7a 蛋白水平显著升高（P＜0.05），β-catenin蛋白水平显著降低（P＜0.05）。见图1。

图1 各组大鼠子宫wnt7a及β-catenin蛋白水平

2.4 大鼠子宫湿重及子宫系数与对照组比较，模型组大鼠体质量、子宫湿重及子宫系数均显著升高（P＜0.05），与模型组比较，理冲汤组及阳性对照组大鼠体质量、子宫湿重及子宫系数均显著降低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠体质量、子宫湿重、子宫系数、子宫平滑肌厚度及子宫组织病理学评分比较（±s）

表3 各组大鼠体质量、子宫湿重、子宫系数、子宫平滑肌厚度及子宫组织病理学评分比较（±s）

注：*表示与对照组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05

组别对照组模型组理冲汤组阳性对照组子宫组织病理学评分（分）0.41±0.03 2.79±0.19*1.03±0.23 0.97±0.17*#鼠数15 15 15 15体质量（g）287.94±2.64 331.19±3.63*297.81±2.43*291.76±3.64#子宫湿重（mg）0.61±0.09 1.51±0.14*0.84±0.12#0.71±0.07#子宫系数（%）0.21±0.08 0.46±0.04*0.28±0.06#0.24±0.03#子宫平滑肌厚度（μm）113.67±6.71 138.21±8.34*120.48±5.38#117.28±4.68#

2.5 大鼠子宫平滑肌厚度及组织病理学评分与对照组比较，模型组大鼠子宫平滑肌厚度及子宫组织病理学评分均显著升高（P＜0.05），与模型组比较，理冲汤组及阳性对照组大鼠子宫平滑肌厚度及子宫组织病理学评分均显著降低（P＜0.05）。见表3。

2.6 大鼠子宫组织病理学观察对照组大鼠子宫组织结构完整，细胞排列整齐，未见明显组织病理学变化，与对照组比较，模型组大鼠子宫组织子宫内膜上皮细胞呈空泡状变性，平滑肌细胞局灶性增生，肌肉内可见明显炎症细胞浸润及细胞坏死、脱落，提示造模成功；与模型组比较，理冲汤组及阳性对照组大鼠组织病理学明显改善，子宫子宫内膜上皮细胞变性减轻，平滑肌细胞排列较整齐，炎性细胞脱落及坏死细胞明显减少。见图1。

图1 各组大鼠子宫组织病理学检查结果（HE，×200）

3 讨论

子宫肌瘤又称为子宫平滑肌瘤，是临床常见的女性生殖器良性肿瘤疾病之一，主要表现为子宫出血、白带增多、不孕或流产、腹部包块隆起及压迫等临床症状［10］。研究表明，子宫肌瘤的发病机制与子宫正常肌层的细胞突变、性激素水平异常及局部生长因子水平紊乱等因素有关［11-13］。子宫肌瘤中雌二醇的雌酮转化明显低于正常肌组织，雌激素受体浓度明显高于周边肌组织，肌瘤组织局部对雌激素敏感性高，同时孕激素能够促进肌瘤细胞增殖，加速子宫肌瘤的生长［14-15］，所以目前大多数学者认为性激素水平异常是子宫肌瘤的主要发病诱因。米非司酮是一种孕激素受体拮抗剂，近年来在临床上被用于子宫肌瘤的治疗，并起到一定的疗效，故本实验选用米非司酮作为阳性对照药。

Wnt/β-catenin 信号通路是传递生长刺激信号的通路，是细胞增殖、分化所必须的重要信号通路之一，Wnt/β-catenin 信号通路与胃癌、肺癌、肾细胞癌等多种肿瘤疾病及糖尿病肾病、骨关节炎、哮喘等疾病的发生密切相关［16-18］。Wnt信号通路转导异常则会影响β-catenin 的磷酸化和降解过程，导致β-catenin 在细胞核内聚集，并与淋巴细胞增强结合因子/T 细胞因子结合，使得细胞质中的β-catenin 移位到细胞核中与TCF 家族形成络合物，促进TCF 和LEF 的转导，进而促使癌基因的高表达。近年来研究表明，Wnt/β-catenin 信号通路及其相关蛋白的异常表达与子宫肌瘤的发生相关［19-20］。有研究报道，子宫肌瘤组织中Wnt7a的低表达，能够导致子宫平滑肌细胞模式发育的失控，进而导致子宫肌瘤的发生，同时β-catenin的异常激活能够诱导子宫平滑肌的异常增生，引发并加速子宫肌瘤的进展［21］。

理冲汤是由生黄芪、党参、白术、生山药、天花粉、知母、三棱、莪术、生鸡内金组成的中药成方制剂，记载于中国传统医学著作《医学衷中参西录》中，有益气行血，调经祛瘀之功效，用于治疗妇人经闭不行，或产后恶露不尽，结为癥瘕，以致阴虚作热，阳虚作冷，食少劳嗽，虚证沓来，室女月闭血枯等多种妇科疾病。近年来王亚松［7］、邹小丽［22］等研究发现，理冲汤对子宫肌瘤大鼠具有显著疗效，同时曹文等［4］报道理冲汤用于子宫肌瘤的治疗在临床中已表现出显著疗效。

雌二醇及孕酮是反映女性体内性激素水平的常用指标，子宫系数能够反映子宫的质量占比，可以间接反映子宫肌瘤的病理进展状态。本研究通过采用苯甲酸雌二醇联合孕酮建立子宫肌瘤大鼠模型，研究理冲汤对子宫肌瘤大鼠的作用及机制，结果表明，与模型组比较，理冲汤组大鼠血清雌二醇及孕酮水平、子宫系数、子宫平滑肌厚度、子宫β-catenin mRNA 水平及β-catenin 蛋白水平均显著降低，子宫wnt7a mRNA 及蛋白水平显著升高，大鼠子宫组织病理学明显改善，提示理冲汤能够通过调节大鼠体内雌二醇及孕酮水平，显著改善大鼠子宫组织病理学进展，并能够调节子宫组织细胞Wnt/β-catenin 信号通路及相关蛋白的表达。由于时间及资金有限，本研究未能对理冲汤对子宫肌瘤大鼠体内与Wnt/β-catenin 信号通路相关的其他信号转导因子做进一步研究，拟在今后研究中对理冲汤的靶向调节作用机制做进一步研究，并对其体内药物代谢动力学特点进行探索。

综上所述，理冲汤能够显著降低大鼠性激素水平及子宫系数，改善大鼠组织病理学变化，其机制可能与调节Wnt/β-catenin信号通路有关。