补骨脂-淫羊藿药对抗绝经后骨质疏松症的网络药理学分析*

杨岩冰，郭云鹏，柴 爽

河南省洛阳正骨医院（河南省骨科医院），河南 郑州 450016

中医古籍中无绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）之名的记载，但“骨痿”“骨枯”等的描述与之十分相似［1-2］。最新的专家共识根据PMOP 的临床症状、体征及定性、定位，认为其当属“骨痿”，辨证分型为脾肾阳虚证、肝肾阴虚证和肾虚血瘀证，其中，推荐肾虚血瘀证患者使用成药壮骨止痛胶囊［3］。壮骨止痛胶囊的药物组成包括补骨脂、淫羊藿、枸杞子、女贞子、骨碎补、狗脊和川牛膝等7 味药物，前期已开展了全方（壮骨止痛方）的作用机制研究［4-6］，组方合理性的分析［7-8］及拆方分析［9-12］，发现补骨脂-淫羊藿药对可提高去卵巢大鼠腰椎骨密度，改善骨生物力学特性，提高血清雌二醇水平。由于补骨脂-淫羊藿是PMOP 治疗中常用的药对，研究其作用机制具有重要意义，故本研究采用网络药理学的方法探讨补骨脂-淫羊藿药对抗PMOP的机制。

1 资料与方法

1.1 补骨脂、淫羊藿有效成分筛选及靶蛋白预测利用TCMSP数据库（http：//tcmspw.com/）［11］，TCM Database@Taiwan 数据库（http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/）［13］和BATAMAN-TCM数据库（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）［14］检索补骨脂和淫羊藿的成分，本次主要研究口服给药后补骨脂-淫羊藿药对的作用机制，故通过口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和类药性（drug likeness，DL）两个指标筛选有效成分，设置OB＞30%，DL＞0.18 为有效成分筛选标准，在BATAMANTCM 数据库中设置评分＞80 为筛选标准［15］，综合获取补骨脂-淫羊藿药对的有效成分。利用以上各个数据库的相关预测模块，预测有效成分的靶蛋白。

1.2 PMOP 相关蛋白的检索利用GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/），OMIM 数据库（https：//omim.org/），GKB 数据库（https：//www.pharmgkb.org/），TTD 数据库（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/），以“Postmenopausal Osteoporosis”“Osteoporosis，Postmenopausal”为检索词，检索各数据库中PMOP的相关蛋白和基因。

1.3 补骨脂、淫羊藿有效成分靶蛋白和PMOP 相关蛋白的标准化处理利用UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/），将物种限定为“Human”，检索补骨脂-淫羊藿药对有效成分靶蛋白和PMOP相关蛋白对应的官方名称，并记录ID编码。检索PMOP 相关蛋白的ID 编码并记录。这样统一采用UniProt 数据库的官方名称和ID 编码，便于后续进行分析。

1.4 补骨脂-淫羊藿药对和PMOP 共同靶标筛选利用在线绘图软件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）筛选补骨脂-淫羊藿药对和PMOP的共同靶标，并绘制韦恩图。

1.5 相互作用网络图的构建通过使用Cytoscape 插件Network Analyzer 进行拓扑分析，读取各个节点的中介中心度（betweenness centrality，BC）和节点度（degree）；使用Cytoscape插件Bisogenet进行可视化分析。

1.6 补骨脂-淫羊藿药对和PMOP 共同靶标的富集分析Metascape（http：//metascape.org/）是一个在线基因功能注释分析在线工具，可以同时执行功能注释和富集分析。将“1.4”项筛选出的补骨脂-淫羊藿药对和PMOP共同靶标输入Meascape平台，输入物种和分析物种均选择“H.sapiens（132）”，然后进行基因本体论（gene ontology，GO），京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，设定P＜0.05的条目被显著富集。

2 结果

2.1 补骨脂、淫羊藿有效成分-靶蛋白网络利用3 个数据库共检索出补骨脂-淫羊藿药对已知的化学成分166 种，其中补骨脂36 种，淫羊藿130种。经过筛选共获得有效成分51 种，其中补骨脂28种，淫羊藿23种。中药的配伍使用依赖于多成分、多靶标和多途径之间的协同作用［16］，因此我们收集了各数据库中靶蛋白共611种，删除UniProt数据库中无法查询到对应基因的和重复数据后，共获得292种靶蛋白。见图1。

图1 中药-有效成分-靶蛋白网络图

为了从系统和整体的角度进一步理解有效成分-靶蛋白网络，我们首先使用Cytoscape构建网络图，发现该网络共包含365个节点和638个边，然后进行拓扑分析获取各个节点的Degree，Degree 表示与此节点相互作用的节点数，其大小与BC 成正比，及依赖此节点的连接越多，此节点的核心性越强，因此我们选择Degree＞5的节点构建网络图，如图1所示，补骨脂-淫羊藿药对共有21个有效成分与26 个靶蛋白相连，其中槲皮素（quercetin）与149 个靶蛋白相连，山柰酚（kaempferol）与61 个靶蛋白相连，木犀草素（luteolin）作用于56 个靶蛋白，异补骨脂甲素（isobavachin）和脱水淫羊藿素（anhydroicaritin）作用于36 个靶蛋白，处于核心位置。

2.2 补骨脂-淫羊藿药对和PMOP 共同靶标的富集分析利用GeneCards数据库收集PMOP相关蛋白963 个，OMIM 数据库36 个，GKB 数据库3 个，TTD数据库3 个，共1005 个。删除重复数据后共获得964个PMOP相关蛋白。

利用UniProt 数据库统一基因名称后，筛选补骨脂-淫羊藿药对和PMOP 共同靶标并绘制韦恩图，共有132 个共同靶标，见图2。将这些共同靶标输入Metascape 平台进行GO，KEGG 富集分析。GO 分为细胞组分（cellular component，CC），分子功能（molecular function，MF）和生物学过程（biological process，BP）3 个方面对基因的本质进行描述，进行基因GO 富集分析可以了解其在Gene Ontology 中的分布和在基因功能上的体现。如图3A-C 所示，显著富集到CC 的GO 条目有膜筏、膜微区、膜区、转录因子复合体、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子复合体；显著富集到MF的GO条目有核受体活性、转录因子活性、类固醇激素受体活性、转录因子结合、蛋白激酶结合；显著富集到BP 的GO 条目有对有毒物质、有机环状化合物、无机物、细胞外刺激和营养水平的反应。KEGG 富集分析如图3D 所示，显著富集的信号通路包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、癌症的途径、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、内分泌耐药、PI3K-Akt信号通路。

图2 补骨脂-淫羊藿药对和PMOP共同靶标

图3 补骨脂-淫羊藿药对和PMOP共同靶标的富集分析

3 讨论

PMOP 的特征是骨骼强度降低和骨骼脆性增加，这是由绝经后妇女的雌激素缺乏引起的。其主要并发症是脆性骨折，导致疼痛，功能障碍，甚至死亡。这种疾病发病隐匿，只有在发生疼痛性骨折（例如股骨颈、脊柱、尺骨、桡骨、肱骨、肋骨和骨盆）后才被发现。骨折常常给人们带来巨大的痛苦，严重限制了患者的生活质量［17］。因此，预防和治疗PMOP 引起了广泛的关注。目前标准的治疗方法是改变生活方式，结合双膦酸盐药物及补充钙和维生素D，以减少破骨细胞驱动的骨吸收［18］。尽管这些药物有效，但大多数药物都有一些局限性和副作用，影响长期给药和依从性［19］。中医药防治骨质疏松由来已久，多从“肝脾肾”三脏论治，用药配伍多选补肾、健脾、活血中药，尤以补肾多见，补骨脂、淫羊藿是常用的补肾壮骨药物，药理研究表明它们在治疗生殖系统、骨质疏松、心血管系统等疾病中具有重要作用［20-23］，但其药理学机制尚未得到系统和全面的发现。网络药理学是一种包括化学信息学，生物信息学，网络生物学和传统药理学的综合方法，提供了一种从系统和整体的角度揭示中药配方的生物活性成分和潜在机制的新策略［24］。本研究采用网络药理学方法，进一步探讨补骨脂、淫羊藿药对抗骨质疏松的作用机制。

首先，我们获取补骨脂-淫羊藿药对有效成分51种，靶蛋白292 个，经过拓扑分析筛选Degree＞5的有效成分21 种，与26 个靶蛋白相连，其中槲皮素（quercetin），山柰酚（kaempferol），木犀草素（luteolin），异补骨脂甲素（Isobavachin）和脱水淫羊藿素（anhydroicaritin）处于核心位置。研究表明槲皮素可以通过调节成骨细胞代谢、抑制细胞衰老抵抗骨质疏松的发生［25-27］，木犀草素可以促进成骨细胞的增殖、分化与矿化［28］，关于异补骨脂甲素的研究多集中在神经元细胞的分化［29］，脱水淫羊藿素是新鉴定的转录因子SREBP2 的抑制剂，可抑制破骨细胞生成并改善糖尿病引起的骨丢失［30］。这些可以解释中草药的多效性。

此外，筛选出补骨脂-淫羊藿药对与PMOP 共有132 个共同靶标，分析发现这些共同靶标在转录因子活性、类固醇激素受体活性、蛋白激酶结合和营养水平等GO 条目显著富集，同时，糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、癌症相关途径、流体剪切应力与动脉粥样硬化、内分泌耐药、PI3KAkt 信号通路可能是补骨脂-淫羊藿药对治疗PMOP的关键。研究表明，绝经后雌激素水平降低与骨质疏松症、动脉粥样硬化及糖尿病相关［31］，这也符合中医学对人体生理和病理状态的整体理解。在人口老龄化进程中，骨质疏松症和糖尿病的发病率不断增长，常合并出现［32］。研究表明，AGE-RAGE信号通路在包括糖尿病性骨病在内的糖尿病并发症中具有重要作用，通过抑制Wnt，PI3K 和ERK 信号传导抑制成骨细胞增殖［33］。此外，淫羊藿可通过多种方式影响内分泌系统及下丘脑-垂体-性腺/肾上腺轴［34］。体外研究发现，成骨细胞加载适宜的流体剪切应力可调节基质金属蛋白酶和其特异性抑制因子的动态平衡，维持机体正常的骨形成和吸收［35］。

骨质疏松症是一种多基因遗传易感疾病。人类遗传基因的多态性决定了人体对疾病和药物的敏感性和反应，以及临床表现的多样性。这类似于中医中“证”的概念，即疾病发展的某个阶段的病理特征的总结，这是身体对致病因素起反应的功能状态。因此，我们推测中医理论基础之一就是多基因性。在这项研究中，我们分析了补骨脂-淫羊藿药对通过多靶点、多途径治疗PMOP 的作用机制，但是，本研究仍然存在一些局限性。首先，我们的有效成分和靶蛋白的收集并不全面。这些可以通过使用液相色谱法、质谱法、二维液相色谱-四极杆飞行时间质谱法等方法来改进。其次，我们的网络药理学研究缺乏动物实验和临床试验来验证这一假设。在以后的研究中，我们将努力进行体内、体外实验来验证补骨脂-淫羊藿药对的作用机制和配伍应用。