酶底物法检测地表水中粪大肠菌群的时间因素探索

周熙 吴梦青 何羽 周玉芳 巩宏平

（1.杭州市余杭生态环境监测站，浙江杭州 311199；2.杭州市临平生态环境监测站，浙江杭州 311199；3.浙江省生态环境监测中心，浙江杭州 310012）

1 引言

与传统的多管发酵法［1］、滤膜法［2］测定水中的粪大肠菌群相比，酶底物法因操作环境要求低、方法简便且检测结果无显著性差异，将是未来实验室的主要应用方向［3］。酶底物法检测粪大肠菌群的原理是在特定温度下培养特定的时间，产生β-半乳糖苷酶，将选择性培养基中的无色底物邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）分解为黄色的邻硝基苯酚（ONP），统计阳性反应出现数量后查MPN 表，计算出样品中粪大肠菌群的浓度值［4］。随着HJ 1001—2018《水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法》的实施，酶底物法检测水中粪大肠菌群的基本方法已经确定，本文在此基础上对一些重要因素进行探索。

查阅已有研究，温度和培养时间对检测结果有显著影响，而使用无菌水或实验室纯水，环境因素和培养方式对检测结果的影响不明显［5-6］。HJ 1001—2018 中要求测定粪大肠菌群时，将封口后的97 孔定量盘放入恒温培养箱中44.5±0.5 ℃下培养24 h。本文探讨培养时间、97 孔定量盘冷藏保存时间这两方面对实际操作有影响的时间因素及季节的影响（一年中不同月份地表水中粪大肠菌群波动情况）。

2 材料与方法

2.1 材料与仪器

远藤氏培养基；Colilert 大肠菌群/大肠杆菌检测试剂；Quanti-Tray 97 孔定量盘；Colilert 97 孔阳性比色盘；恒温培养箱；97 孔定量盘封塑设备。

2.2 样品来源

样品来源于杭州市余杭区地表水（河流水及水库水）。

2.3 水样采集

用采水器或其他灭菌器采集水样放入灭菌瓶内。

2.4 方法

除设定条件外，测定按照HJ 1001—2018 中的规定操作。

3 结果与分析

3.1 培养时间的影响

虽然培养时间24 h 已经比传统的初发酵24 h+复发酵24 h 节约了一半时间，但在实际工作中如果能进一步缩短或延长时间，仍然有其现实意义。有研究指出，酶底物法检测总大肠菌群培养温度控制在35～37 ℃的情况下，培养时间在22～28 h 之间可以得到准确结果，而大肠埃希氏菌的检测则需24～28 h［5］。表1 中将地表水样品分别稀释1，10，100 倍，以对应不同河流水库中高中低浓度的样品，稀释用水和空白样用水均为无菌水。

表1 粪大肠菌群97 孔定量盘阳性格数时间变化

从表1 中可以看出，高浓度未稀释样品在24 h内97 孔定量盘会全黄，通过平时大量的观察，这一时间从数小时到二十几小时不等。对于考核指标等于或严于GB 3838—2002《地表水环境质量标准》中Ⅳ类水（粪大肠菌群低于20 000 个/L）的水体，可以不稀释，并在培养时间小于24 h 发现定量盘全黄时，结束培养，得出定性结论。定量盘非全黄的样品在培养时间超过24 h 后，仍会有少量孔变黄，因此24 h 为标准规定时间，而非ONPG 分解全部完成时间。

3.2 定量盘冷藏保存时间的影响

在结束培养后需立即读取定量盘变化孔数，否则随着时间的延长，变黄孔数很可能继续增加，尤其是夏季高温环境下总大肠菌导致的变黄孔数增多。如果不能及时读数或者需要事后检查确认，是否可以将定量盘冷藏保存一段时间，本节对此进行探讨。图1 是完成培养当天、冷藏3 d 后、冷藏7 d 后的定量盘照片，变黄孔数没有明显变化。因此，结束培养后，如不能及时读数，可将定量盘冷藏保存一段时间再读数，不过如有个别临界状态的孔还是应该尽早读数。稳妥起见，可以在培养结束后对定量盘拍照，与同一位置的标准阳性比色盘照片对比读数，照片还可以留存备案。

图1 结束培养后定量盘冷藏时间变化

3.3 季节的影响

一年中不同季节地表水的粪大肠菌群是否存在规律性波动，是否会有季节的明显区别，本节将对此进行探讨。图2 是杭州市余杭区5 个断面（瓶窑水厂取水口、奉口、径山水厂取水口、仁和水厂取水口、闲林水库）2022 年粪大肠菌群均值（MPN/L）的变化趋势，可以看出较热月份（6 月、9 月）粪大肠菌群出现高值的可能性会高于其他季节，这应该和水中微生物活性增强有关，而最热的7 月、8 月粪大肠菌群数值不高，应该与气温过热有关。

图2 杭州市余杭区5 个断面2022 年粪大肠菌群均值

4 结论

（1）酶底物法检测粪大肠菌群，在定性要求严于Ⅳ类水的情况下，发现定量盘全黄即可结束培养，不必等到24 h。

（2）结束培养后，如不能及时读数，可将定量盘冷藏保存一段时间再读数，或拍照与标准阳性比色盘照片对比读数。

（3）较热月份粪大肠菌群出现高值的可能性会高于其他月份。