高效液相色谱法测定保健食品中红景天苷及方法学优化*

梁柳泳，张 飞，梁洁怡，林嘉婷，夏 冰，蔡群娣，丁少曼，李欣洁，黄 敏

(广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心)，广东省化学测量与应急检测技术重点实验室，广东省保健食品功效成分检测与风险物质快速筛查工程技术研究中心，广东 广州 510070)

红景天为景天科多年生草本植物，是我国著名的珍贵植物，大多生长在高寒无污染地带，能够适应强紫外线、干燥和缺氧等恶劣环境，且具有独特的活性成分[1]。红景天含有40多种化合物，其中主要功效成分为红景天苷[2-3]。红景天苷为浅棕红色至白色结晶粉末，具有多种药理功效，包括：提高机体免疫力，抗缺氧、抗疲劳、抗辐射，保护心脑血管和预防高原反应等作用[4-6]。1991年我国卫生部已经将红景天纳入到新食品资源名单[7]。

随着红景天提取物在保健食品行业应用越来越广，市场上以红景天苷为主要功效成分的保健食品也是琳琅满目，包括胶囊、片剂、粉剂和口服液等。选用准确可靠，通用性好的检测方法是做好保健食品质量控制的重要手段。红景天苷的常用检测方法有高效液相色谱法、气相色谱法和极谱法等[8-11]。目前测定红景天苷现行的标准方法有：《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)和《保健食品及其原料安全性毒理学检验与评价技术指导原则(2020年版)。上述两种方法流动相均含有缓冲盐，使用不当可能造成盐析，损坏色谱柱和仪器；该色谱条件在分离某些样品时有杂质干扰；检测波长较低，某些样品基质干扰较大；针对的试样类型不全。针对上述问题，本试验参照上述两种标准方法，通过对样品前处理和色谱条件进行优化，建立了多种类型保健食品中红景天苷的高效液相色谱分析方法，并对市售的16种保健食品和原料进行测定，结果表明该方法快速、准确可靠和适用范围广。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

LC-20AB高效液相色谱仪-二极管阵列检测器，日本Shimadzu公司；BT125D电子天平，赛多利斯科技有限公司；Fisherbrand 超声波清洗器，飞世尔实验器材(上海)有限公司；高速冷冻离心机，日本Hitachi公司；TDZ5-WS离心机，湘仪离心机仪器有限公司；JYL-C022E料理机，九阳股份有限公司；HH-6数显恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司；MS 3旋涡混匀仪，德国IKA公司。

红景天苷(99.8%)，中国食品药品检定研究所；乙腈、甲醇(色谱纯)，霍尼韦尔国际公司；甲醇、乙酸铵、正己烷(分析纯)，广州化学试剂厂；一级水(自制)。

1.2 标准物质

标准储备液：精密称取0.010 08 g于100 mL容量瓶，甲醇溶解并定容，配成100 mg/L的标准储备液。

系列标准工作液：分别移取 0.500 mL、2.00 mL、5.00 mL、10.0 mL、25.0 mL的标准储备液至 50 mL容量瓶，用甲醇定容，配制得到质量浓度分别为 1.00 mg/L、4.00 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L 的系列标准工作液。

1.3 色谱条件

色谱柱：Unitary C8色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈/水(12∶88，V/V)；流速：1.0 mL/min；进样体积：20 μL；检测波长：275 nm；柱温35 ℃。

1.4 样品前处理

样品预处理：片剂：取20片粉碎并研磨成粉；软胶囊：取20粒胶囊内容物，搅拌均匀，如果内容物含油，应尽可能挤干净；粉剂胶囊：取20粒胶囊内容物，混匀。

样品提取：固体试样：称取0.3～0.5 g(精确至0.1 mg)于50 mL刻度离心管，加入80%甲醇溶液45 mL，超声提取20 min，每5 min摇匀一次，冷却至室温，用80%甲醇溶液定容至刻度，摇匀后以 4 000 r/min离心5 min，取上清液经0.45 μm有机膜过滤上机。

含油试样：称取0.3～0.5 g(精确至0.1 mg)于50 mL刻度离心管中，加入10 滴正己烷后旋涡振荡分散均匀，加入80%甲醇溶液45 mL，超声提取20 min，每5 min摇匀一次，冷却至室温，用80%甲醇溶液定容至刻度，摇匀后以 4 000 r/min离心5 min，取上清液经0.45 μm有机膜过滤后上机。

液体试样：称取摇匀后的试样1～5 g于烧杯内，水浴蒸干。用80%甲醇溶液溶解并转移至50 mL刻度离心管中，超声提取20 min，冷却至室温后用80%甲醇溶液定容至刻度，摇匀后以 4 000 r/min离心5 min，取上清液经0.45 μm有机膜过滤后上机。

如果上述样品供试液中红景天苷的质量浓度超出红景天苷标准工作液的浓度范围(1.00～50.0 mg/L)，供试液还需要进行稀释或浓缩。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

采用本试验方法对红景天苷标准溶液和样品进行测定，所得色谱图见图1，红景天苷保留时间为6.7 min。由图1可知，红景天苷色谱峰形良好，分离度高，干扰较小。

图1 标准品和样品的色谱图Fig.1 Chromatogram of standards and samples

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 检测波长的选择

本试验配置的检测器是光电二极管阵列检测器，在色谱分析的同时可获得红景天苷的紫外吸收光谱图，由光谱图可知红景天苷在215 nm和275 nm均有较强吸收，由于215 nm接近常用有机溶剂(甲醇、乙腈等)的紫外吸收截止波长，容易引起较大的基线噪音，因此检测波长选择275 nm。

2.2.2 色谱柱的选择

常用的反相色谱柱有C18柱和C8柱，其中C18色谱柱应用最广，而关于C8色谱柱的应用报道较少。在同等色谱条件下，分别采用C18色谱柱和C8色谱柱对样品进行测定。采用C18色谱柱分离时，灵芝孢子胶囊供试液中有杂质干扰红景天苷色谱峰，而采用C8色谱柱可实现良好分离。因此选择C8色谱柱为分离柱。

2.2.3 流动相优化

在反相高效液相色谱中，流动相常选甲醇-水体系或乙腈-水体系。由于乙腈洗脱能力优于甲醇，获得的红景天苷色谱峰形较好，所以选择乙腈-水体系作为流动相。考察流动相中不同的乙腈比例对红景天苷分离的影响，结果表明流动相中乙腈/水的体积比为12：88时，分离度好，色谱峰形尖锐。

2.3 前处理的优化

2.3.1 提取剂种类的选择

样品为灵芝孢子粉胶囊，分别采用甲醇、乙醇和丙酮为提取溶剂。结果表明：甲醇提取率最高，而且色谱峰形良好；乙醇提取率次之，峰形较差；采用丙酮提取，样品中红景天苷为未检出。综上所述，选择甲醇作为提取剂。

2.3.2 甲醇比例的优化

样品为灵芝孢子粉胶囊，分别考察100%、80%、60%、40%、20%的甲醇溶液对红景天苷提取率的影响。结果表明80%甲醇溶液测得提取率最高，因此选择80%甲醇溶液为提取剂。

2.4 线性范围、检出限和定量限

以系列标准工作液质量浓度(mg/L)为横坐标，对应的色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线。求得线性回归方程为Y= 4 245X-614。相关系数为 0.999 9。由此可知红景天苷在 1.0～50 mg/L 范围内线性良好。

当称样量为0.4 g，定容体积为50 mL，检出限为0.132 g/kg(信噪比S/N=3)，定量限为0.436 g/kg(信噪比S/N=10)。检出限和定量限均可满足试验要求。

2.5 日内与日间精密度

日内精密度：取灵芝孢子粉胶囊供试液连续进样6次，求得供试液中红景天苷峰面积的相对标准偏差为1.21%，说明该方法的日内精密度良好。日间精密度：将上述供试液连续7 d进行测定，求得相对标准偏差为2.26%，说明该方法日间精密度良好。

2.6 回收试验和相对标准偏差

称取枸杞片和颐年口服各 6份平行样，分别加入低、中和高3个质量浓度，n=2，计算求得加标回收率和相对标准偏差见表1。由表1可知该方法加标回收率和相对标准偏差均满足实验要求。

表1 回收试验结果Table 1 Recovery test results

2.7 实际样品的测定

选取市售的16种保健食品及原料进行测定，测定结果见表2，测得含量结果均满足相关产品标准要求。

表 2 实际样品的检测结果Table 2 Test results of actual samples

续表2

3 结 论

本试验优化了保健食品中红景天苷的高效液相色谱分析方法，该方法简便快速，重现性好和准确度高。对于某些保健食品，采用C8色谱柱进行分离，可获得更好的分离度，确保了结果准确性；流动相不含缓冲盐，可降低流动相对色谱柱和仪器的损害。目前，采用C8色谱柱分离红景天苷的应用研究较少，本试验结果表明C8色谱柱适用于红景天苷的分析测定，也可为其他醇苷类化合物的分析提供技术参考。