双波长HPLC-PDA法同时测定鼠尾草中迷迭香酸和芦丁的含量*

付恩桃，王文宇，何继云，刘修树，汤 洁，龚菊梅，李会婷

(1 合肥职业技术学院，安徽 合肥 238000；2 合肥师范学院，安徽 合肥 238000；3 中国科学技术大学附属第一医院/安徽省立医院，安徽 合肥 230001)

唇形科鼠尾草广泛分布在世界各地，约有千余种，在中国可作为药用的该属植物有约30种。主要生长在山坡、水边及林荫下，分布在新疆、安徽、江西、福建、广西等省区，为小灌木植物。鼠尾草多以根茎或全草入药。现代药理研究表明，鼠尾草具有抗HIV活性、抗肿瘤活性、抗氧化、抗炎及抑菌等作用，作为中国传统中药，鼠尾草又常以丹参替代品的形式广泛应用[1-3]。迷迭香酸多种神经系统疾病有不同程度的干预作用，尤其是阿尔茨海默病，研究表明，迷迭香酸可改善阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力[4]。芦丁可明显改善患者的神经功能、促进预后，此外还有抗氧化、抗炎及抗病毒等作用[5]。由于《中国药典》(2020年版)并未收载鼠尾草，目前没有统一的质量控制标准，因此很难保证鼠尾草的药材质量。目前已报道的文献只对鼠尾草中迷迭香酸或者芦丁进行了单独定量，仅测定一个成分的含量，不足以说明鼠尾草药材的质量[6-7]。目前尚未见采用不同波长同时测定不同产地鼠尾草根茎中迷迭香酸和芦丁这两种成分的方法，测定这两种成分的含量对鼠尾草药材的质量控制具有十分重要的意义。本课题所建立的方法采用等度洗脱，因而可最大限度提高分析的效率，以期为全面建立其质量评价标准，早日纳入《中国药典》提供理论参考。

1 实 验

1.1 仪器与试药

ALLiance e2695型Waters高效液相色谱仪、KQ-300VDE型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发器，上海青浦沪西仪器厂；HH-2型数显恒温水浴锅，常州越新仪器制造有限公司；五批鼠尾草(产地：安徽、河南、四川、云南、河北)等地，经合肥职业技术学院中药学教授刘修树鉴定为唇形科鼠尾草属植物鼠尾草(Salvia cavaleriei)的干燥根和根茎，迷迭香酸和芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号分别为：111871-202007，纯度98.1%、100080-202012，纯度91.6%)；水为超纯水；乙腈、磷酸为色谱纯；其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

以大连依利特Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)为固定相，乙腈-0.1磷酸水溶液 (20∶80)为 流 动 相，进样体积20 μL，流 速 为1.0 mL/min，双波长检测：迷迭香酸(330 nm)、芦丁(256 nm)，柱温25 ℃。色谱图中迷迭香酸和芦丁的峰与其它非检测杂质峰的分离度均大于1.5，符合测定要求。对照品溶液、供试品溶液色谱图如图1所示。

图1 A、C为254 nm波长下芦丁，B、D为330 nm波长下迷迭香酸的色谱图Fig.1 A and C are chromatograms of rutin at 254 nm，B and D are chromatograms of rosmarinic acid at 330 nm

2.2 对照品溶液制备

精密称取迷迭香酸、芦丁对照品10.30 mg、9.90 mg，分别置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得到1.03 mg/mL、0.99 mg/mL的单一对照品储备液。另分别精密量取迷迭香酸对照品储备液2 mL、芦丁对照品储备液1 mL，置同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得浓度分别为206.0 μg/mL、99.0 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取过6号筛的鼠尾草药材根茎粉末1 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇30 mL，密塞，于水浴锅中加热回流40 min，放冷，转移至50 mL量瓶中，再用50%乙醇溶液润洗锥形瓶3遍，润洗液一并转移至量瓶中，然后再用50%乙醇定容至刻度，摇匀，静置，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，进样测定。

2.4 线性关系考察

分别精密移取“2.2”中的混合对照品溶液0.1，0.2，0.5，1，2，5 mL置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀释定容至刻度，得到系列混合对照品溶液。分别进样测定迷迭香酸和芦丁的峰面积，以系列浓度C为横坐标，系列峰面积为纵坐标，进行线性回归，求得迷迭香酸和芦丁的回归方程分别为：A=78 134C-13 179(r=0.999 8)，A=43 078C+8 927.3(r=0.999 9)，线性范围分别为：2.02～101.04 μg/mL，0.91～45.34 μg/mL。

2.5 精密度试验

取线性关系中间浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，计算得到迷迭香酸、芦丁峰面积的RSD分别为0.41%，0.32%，表明精密度良好。

2.6 重复性试验

精密称取产地为安徽的鼠尾草药材6份，每份约1 g，按“2.3”方法制备溶液，分别进行测定，结果迷迭香酸和芦丁含量分别为2.366 mg/g，0.494 mg/g，RSD分别为0.82%和1.10%，表明重复性良好。

2.7 稳定性试验

取安徽产鼠尾草供试品溶液，室温下放置，分别于0、2、4、6、8、12 h各进样1次，进样量20 μL，迷迭香酸、芦丁峰面积的RSD分别为0.56%、0.92%，表明供试品溶液12 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的安徽产鼠尾草药材9份，每份约1 g，分成低、中、高三组，分别加入迷迭香酸对照品储备液2.0、2.5、3.0 mL，芦丁对照品储备液0.4、0.5、0.6 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，并计算回收率，结果如表1所示。

2.9 样品含量测定

取不同产地的鼠尾草，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行分析，测定峰面积，采用外标法计算迷迭香酸和芦丁的含量，测定结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=3)

3 讨 论

3.1 提取条件的选择

本实验采用单因素方法，分别考察了不同浓度乙醇(0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%)，料液比(1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50)，提取时间(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)，于不同条件下对鼠尾草中迷迭香酸和芦丁提取结果的影响，单因素考察结果如图2所示。最终确定的最佳提取条件为称取药材1 g，50%乙醇溶液，料液比1∶30，提取时间40 min。同时对超声和回流提取两种提取方法进行了对比，依据测定结果，回流提取法效果较好。

图2 单因素实验考察结果Fig.2 Results of single factor experiment

3.2 检测波长的选择

本实验采用二极管阵列检测器3D模式在200～400 nm紫外光区对迷迭香酸和芦丁两种成分进行了全波长扫描，依据保留时间提取得到迷迭香酸和芦丁的紫外图谱，显示芦丁的最大吸收波长为256.1 nm和353.9 nm，迷迭香酸的最大吸收波长为329.9 nm，结合相关文献报道和实验研究结果[8]，选择芦丁(256 nm)、迷迭香酸(330 nm)条件下，这两种成分的响应较好，且附近无干扰，因此采用双波长对迷迭香酸和芦丁同时进行测定。

3.3 流动相的选择

实验中分别比较了甲醇-水、甲醇-磷酸水、乙腈-水以及乙腈-磷酸水等不同的流动相体系，发现添加少量的酸对改善峰形有较大帮助，另外乙腈的洗脱能力比甲醇更强，因此，在保证待测成分与其它成分完全分离、待测成分峰形良好的的情况下，同时为了提高分析效率，最终选择乙腈-0.1%磷酸水溶液(20∶80)作为流动相。

4 结 论

本试验建立了双波长法同时测定鼠尾草中迷迭香酸和芦丁的含量，采用等度洗脱，能够快速、准确的对鼠尾草药材质量进行评价。结果显示，不同产地鼠尾草中迷迭香酸和芦丁的含量差异较大，本试验结果显示，河南产地的鼠尾草药材中迷迭香酸和芦丁的含量相对较高，可能与植物所处的生长环境、光照、气候等因素密切相关。本试验分别在迷迭香酸和芦丁的最大吸收波长处测定其含量，能够提高测定结果的准确性，为鼠尾草药材的质量控制提供科学依据。