烘焙培根中的碳点的鉴定及毒性评价*

苏 燚，吴艳阳，赖灯妮，李 涛

(1 湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙 410128；2 湖南省农业科学院农产品加工研究所，湖南 长沙 410002)

培根(bacon)是由畜肉去骨、腌制、滚揉、成型、干燥、蒸煮、烟熏或其他工艺加工制成的一种西式肉制品[1]。由猪的腹部肉、肋条肉或背脊肉制作而成的培根富含水分、脂肪、蛋白质等营养成分，具有浓郁的烟熏味，咸味适口，肥而不腻，深受世界各地人民的喜爱[2]。根据原料肉和加工工艺的不同，可将培根分为大培根、排培根、奶培根等。但生培根的钠含量一般为715～1 570 mg/100 g(对应的氯化钠含量为1.8%～4.0%)[3]，烘焙后培根中的钠含量还会升高[4]。过量钠盐的摄入会增加患高血压、心血管等疾病的风险[5]。并且热加工也可诱发多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)等多种危害物的产生。PAHs具有毒性、致癌、致畸和突变性[6]。

2004年Xu等[7]用电弧放电法，分离纯化单壁碳纳米管后，发现了具有荧光性质的碳纳米颗粒。2006年，Sun等[8]激光烧灼石墨粉末，得到了具有较高量子产率(>10%)的荧光碳纳米粒子，并将其正式命名为“carbon dots”，即碳点(carbon dots，CDs)。目前，被广泛接受的碳点定义是：零维的荧光碳纳米结构。由于相较于传统材料而言，碳点具有原料廉价易得、光学性质独特、合成方便简单、具有优秀的细胞相容性和抗光漂白能力等无可比拟的优势。因此碳点广泛应用在光催化[9]、废物处理[10]、化学/生物传感[11-12]、生物成像[13]和纳米医学[14]等众多领域。

然而食品热加工过程中，碳点自发形成的新型纳米结构，能产生一定的毒性。碳点的毒性除了与材料本身的纯度，尺寸大小，化学结构和所带电荷等有关之外，还与曝露的时间，途径以及碳点的表面修饰和活性密切相关[15]。不同碳点的毒性大小更是有所差异，其粒径越小，其潜在毒性越大[16]。碳点可以降低细胞活力、促进细胞凋亡，主要是因为它们能发生氧化应激、炎症反应，诱导DNA损伤，破坏细胞和器官正常功能。一些碳点通过呼吸、口腔、皮肤等途径进入身体，在相应的靶器官上蓄积，引发各种疾病反应[17]。本文以培根为研究对象，从烘焙的培根中提取纯化的碳点，对其进行鉴定，测定其毒性大小。

1 实 验

1.1 材料与试剂

培根购于沃尔玛超市；乙酸乙酯、无水乙醇、二氯甲烷、氯化钠、浓硫酸、氢氧化钠(分析纯)，中国医药集团有限公司；透析袋(3000 Da，500 Da)，北京索莱宝科技有限公司；溴化钾(色谱纯)，百灵威科技有限公司；碘化丙啶(Propidium iodide，PI)、膜联蛋白V/异硫氰酸酯荧光素(annexin V-FITC)凋亡检测试剂盒(556547)，上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞来源

正常大鼠肾细胞(normal rat kidney，NRK)美国典型培养物保藏中心(American type culture collection，ATCC)，编号为CRL-6509。

1.3 仪器与设备

JEM-2100(UHR)透射电子显微镜，日本电子株式会社；ATX224型电子分析天平，日本岛津；LDZX-75KBS傅里叶变换红外光谱仪，美国赛默飞世尔科技公司；ESCALAB250X射线光电子能谱、F-2700X射线光电子分析仪，美国赛默飞世尔科技公司；VORTEX-6涡漩振荡器，其林贝尔仪器制造有限公司；ZXPK409001烤箱，广东乐创电器有限公司；JEM-2100(UHR)旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器；Z2002-0161时间分辨荧光光谱，英国爱丁堡仪器公司；流式细胞仪，卡尔蔡司公司。

1.4 实验方法

1.4.1 烘焙培根中碳点的提取

将培根以200 ℃加热10 min后 放入在无水乙醇中浸泡12 h后过滤、旋蒸，用4倍体积的二氯甲烷提取溶液中的脂溶性杂质。在10 000 rpm 进一步离心10 min。然后取上清液，用0.22 nm的水系膜过滤，再放至3 500 Da的透析袋中透析3天；最后用 Sephadex G-25柱纯化；冷冻干燥后即得到碳点的固体样品，放入-20 ℃冰箱内长期保存。

1.4.2 透射电镜鉴定碳点的大小

将碳点用超纯水稀释100倍后，将其滴到200目的电镜铜网上，干燥后用透射电镜对其形貌、直径进行分析进行观察。

1.4.3 碳点的表面基团的鉴定

将碳点与KBr按1∶200的比例混合压片后，用傅里叶红外变换光谱仪(fourier transform infrared spectrometer，FTIR)测定碳点的表面基团。在条件为4 000～500 cm-1范围内扫描。

1.4.4 碳点的元素组成的鉴定

为了进一步确认碳点的组成与结构，将碳点研磨成颗粒均匀，并直径小于0.2 nm，放入X射线光电子能谱仪(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)鉴定，鉴定实验选用单色波的值为1 486.6 eV的AlKα的辐射能为确定核心级的结合能，C1s峰结合能为284 eV和N1s峰399 eV作参考峰。

1.4.5 碳点的荧光寿命的鉴定

用时间分辨荧光光谱仪对碳点的荧光寿命进行鉴定，拟合后得到荧光衰减曲线，通过计算得到其荧光寿命。

1.4.6 碳点毒性大小的检测

碳点处理NRK细胞12 h后，用磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline，PBS)洗涤两次，加入1 mL胰酶，1 min后，移出胰酶。再加入之前收集的细胞培养液，进行离心，条件为 1 000 rpm离心5 min，收集沉淀细胞。往离心管中的细胞加入500 μL的FITC-annexin V结合液，使NRK细胞重悬后。再加入1 μL的FITC-annexin V，混匀后，室温孵育10 min。加入1 μL的PI染色液，混匀后，室温避光环境中冰浴中孵育10 min到20 min。流式细胞仪上机进行检测。条件为激发波长Ex=488 nm，发射波长Em=530 nm。

1.5 数据处理

用IBM SPSS Statistics 25软件进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 碳点的粒径表征

我们用200 ℃ 烤制10 min培根，提取并纯化烤制培根中的碳点。使用透射电子显微镜观察碳点的的形貌为大小相近的球形结构，不产生团聚现象，呈分散态，通过统计计算出碳点的平均粒径分别为1.55 nm (图1A和图1B)。

图1 碳点形貌的鉴定：透射电镜鉴定烘焙培根中碳点的形态 和直径(标尺为20 nm)(A)；碳点的尺寸分布统计图(B)Fig.1 Identification of the carbon-point morphology：TEM image of the carbon dots from baked bacon(the scale bar is 20 nm)(A)； Statistical plot of the size distribution of the carbon dots(B)

2.2 碳点的表面基团表征

为研究烘焙培根中的碳点的理化性质，我们运用时间分辨荧光光谱仪、傅里叶红外光谱仪和X射线光电子能谱分析烘焙培根中碳点的荧光寿命、表面基团和元素含量。结果显示该碳点的其荧光寿命约为5.37 ns(如图2A)。傅里叶红外线吸收光谱的结果如图2B所示。3 418 cm-1处的吸收峰是由于O-H伸缩振动，在碳点的表面形成羟基，具有亲水性。2 932 cm-1处的吸收峰是由于-CH2的拉伸振动引起的，碳点的表面形成亚甲基结构。2 854和1 535 cm-1处的吸收峰由于-CH-弯曲振动，碳点的表面形成次甲基结构。C=O的典型吸收峰位于1 658 cm-1处，说明碳点的表面形成羰基结构。这些结果说明碳点表面基团主要是由羟基、次甲基、亚甲基和羰基组成。

图2 碳点的荧光特性和表面基团的分析：烘焙培根中碳点 的荧光衰减曲线(A)，傅里叶红外光谱仪分析 烘焙培根中碳点的表面基团(B)Fig.2 Analysis of fluorescence characteristics and surface groups of carbon dots：Fluorescence decay curves of carbon points in baked bacon(A)and FTIR analysis of carbon dots from baked bacon(B)

2.3 碳点的组成元素鉴定

图3中的X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy， XPS)的结果显示，烘焙后培根中的碳点电子能谱出现三个峰，分别为C1s、N1s和O1s。元素组成分别为C 71.69%、O 18.84%和N 9.07%。其中C1s、N1s在284和399 eV处。C1s高分辨光谱分析表明显示存在结合能为284.5 eV的C=C键，C-O或C-N在285.5 eV；O-C=O在286.4 eV；C=O在288.6 eV。N1s的高分辨率光谱显示C-N=C、胺和酰胺的主要峰为398.1和398.6 eV，H键和质子化胺为398.6 eV。

图3 碳点元素及基团组成：X射线光电子能谱检测碳点的元素含量(A)；烘焙培根中碳点的碳点C1s的高分辨图谱(B)； 烘焙培根中碳点的N1s的高分辨图谱(C)Fig.3 Carbon point elements and group composition：The element content of carbon dots tested by X-ray photoelectron spectroscopy (A)； High-resolution spectra of C1s (B)；High-resolution spectra of N1s(C)

2.4 碳点毒性大小的分析

我们采用PI和FITC-annexin V探针，通过流式细胞术，NRK细胞的毒性影响。如图4所示，1 mg/mL碳点处理NRK细胞12 h后，细胞凋亡率从4.59%增加到20.09%。这表明碳点使NRK细胞发生凋亡。

图4 烘焙培根中的碳点使NRK细胞发生凋亡：1 mg/mL碳点处理 NRK细胞 12 h后，利用流式细胞术，采用Annexin V-FITC 和PI探针标记细胞，检测细胞凋亡的情况(A)；FITC-annexin-V和PI染色法检测1 mg/mL碳点孵育12 h后 NRK细胞凋亡率(误差线，S.D.)(B)Fig.4 Carbon dots in baked bacon induces apoptosis of NRK cells：After NRK cells were treated with carbon dots for 12 h， the cells were analyzed by flow cytometry and labeled with Annexin V-FITC and PI probe for analysis of apoptosis(A)， FITC-Annexin-V and PI staining were used to test the apoptosis rate of NRK cells after incubation with carbon dots of 1.0 mg/mL for 12 hours. Error bars，S.D.(B)

3 结 论

碳点可通过人工合成和食品热处理产生。人工合成碳点主要是“自上而下”和“自下而上”这两种方式。“自上而下”通过物理/化学方法分解宏观尺寸块体，是早期制备碳点的主要原理。其制备方法主要有电弧放电法[7]、电化学法[18]、激光消融法[19]和超声波法[20]等。“自下而上”指热解或碳化有机小分子来合成碳点。其制备方法主要有水热溶剂热法[21-22]、模板法[23]、微波裂解法[24-25]和高温热解法[26]等。热处理食品时食品成分之间会发生各种相互作用，与高温热解合成碳点的方式相似，碳点会发生碳化和聚集现象。我们烘焙培根后用透射电镜，确定了碳点的直径和形貌，傅立叶变换红外光谱鉴定了烘焙培根的表面基团。X射线光电子能谱的结果显示该几种碳点主要的元素为C、N和O组成，且碳元素含量最高。

烤羊肉[27]、牛肉[28]、饮料[29]、鸡肉[30]、汉堡[31]和速溶咖啡[32]等中都发现了碳点。均验证这些碳点对细胞有一定的毒性，我们的数据进一步证实了烘焙培根中的碳点诱导NRK细胞凋亡。而烘焙培根中的碳点形成机制和致细胞毒性大小机理有待阐明。目前，对于纳米材料的毒性研究多数学者集中在单一的纳米粒子上，而现实中通常是多种同时存在，不同纳米颗粒的毒性机制不同，且它们之间可能产生相互作用，以致它们的毒性效能往往也可能不太一样：如 SiO2NPs和TiO2NPs在巨噬细胞的炎性响应上表现为协同作用[33]；而ZnONPs和TiO2NPs共同暴露时，ZnONPs溶解释放的Zn2+由于被 TiO2NPs吸附，削弱了对细菌ATP水平的影响[34]。随着新型纳米材料的广泛使用以及人们对于单一碳点毒性剂量、作用机理的了解深入，越来越多的研究更加关注它们的联合毒性这一更具挑战性和现实性的问题。因此，不同热加工食品中的碳点的联合毒性大小和毒性机制研究有待阐明。