光热增强抗菌水凝胶的制备及其性能研究*

林 晓，赵俊泽，周舒文，邱 琳

(1 常州大学质量管理与评估中心，江苏 常州 213164；2 常州大学药学院，江苏 常州 213164)

《教育部关于深化本科教育教学改革全面提高人才培养质量的意见》指出，要强化科研育人功能，推动高效及时把最新科研成果转化为教学内容，激发学生专业学习兴趣[1]。相比于传统机械式的实验教学，以教师的科研工作为基础构建的创新实验项目更有利于科研反哺教学计划的落实。在此过程中，学生由被动的接受者转变为自主“学习研究和发展”的主体，不再抱着功利性的心态去完成实验教学目标，而是尝试着主动思考，及时拓宽知识面查缺补漏，用更加积极的态度面对并解决问题，真正做到学以致用[2-5]。

由获得耐药性或通过生物膜形成引起的抗生素耐药性细菌感染愈发增加，为伤口感染治疗带来了巨大挑战。基于纳米载药系统负载靶向抗菌肽的治疗方法，能够逃避现有细菌获得耐药性的相关机制。此外，纳米材料的独特尺寸和物理性质使它们能够靶向穿透和破坏生物膜，克服顽固感染。本文以实现抗菌肽和纳米材料在抗菌治疗中的实际应用为目标，围绕纳米载药系统的设计与合成展开研究工作。本文在笔者前期的科研工作基础上设计了一个光热增强的抗菌水凝胶用于体外抗菌活性研究的综合性创新实验。水凝胶富含的大量水分和类细胞外基质(ECM)的三维网络结构使其具有了“理想敷料”的大部分特征，包括维持伤口湿润和氧交换，提供敏感组织的无粘合覆盖，并以优异的顺应性减少伤口疼痛[6-8]。纳米载药系统是指纳米载体为基础，可以包封或负载药物，粒径分布在一到数百纳米之间，可以将药物高效递送至病灶部位的药物输送系统，目前已在伤口感染、癌症治疗等领域被广泛研究。纳米载药系统的核心目的是以最小的副作用达到治疗部位所需的药理作用，因此纳米载药系统的研发策略是以生物安全性为基础，提高药物分子的治疗效果为方向，进行开发和优化。泊洛沙姆(F127)是一种聚氧乙烯和聚氧丙烯醚的共嵌物，在水介质中可自组装形成水凝胶，此过程可由浓度和温度控制[9]。金纳米星(AuNs)是具有多分支尖端结构的金纳米颗粒，相较于其他形态，AuNs有更大的表面体积比，有利于进行药物装载。AuNs的分支尖端有利于磁场聚焦效应，表现为更高效的光热转化效率，同时具有良好的光稳定性和生物安全性。

在本实验中，首先将Cy7标记的抗菌肽(序列为GLFVDK-GKRWWKWWRRGC)和PEG-SH通过金硫键锚定在金纳米星上，以提高纳米材料整体的稳定性和光热抗菌活性。然后将其引入至F127水凝胶中进行包裹，利用抗菌肽固有的杀菌活性和Cy7与金纳米星在近红外光下优异的光热转换能力，赋予水凝胶光热增强的抗菌性能。该抗菌水凝胶作为新型敷料在细菌感染的伤口愈合方面具有潜在的应用价值。

1 实 验

1.1 实验试剂与仪器

试剂：化学修饰的α-氨基酸、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)，吉尔生化有限公司；三异丙基硅烷(TIS)、N-乙基二异丙胺(DIEPA)、1，2-乙二硫醇(EDT)、三氟乙酸(TFA)、氢氧化钠、巯基聚乙二醇(PEG-SH)，国药基团化学试剂有限公司；H-Rink Amide ChemMatrix树脂、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、氯金酸，Sigma；Cy7，百灵威化学技术有限公司；金纳米星(AuNS)是根据先前报道的方法进行合成[10]；胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)、胰酪大豆胨液体培养基(TSB)，杭州微生物试剂有限公司；其余试剂均购自Adamas-Beta。

仪器：Shimadzu LC-8A高效液相色谱，日本岛津；Tecnai G20透射电子显微镜，美国 FEI公司；ZS90 Malvern粒度仪，英国马尔文；Synergy NEO酶标仪，美国伯腾公司；MDL-N-808-10W近红外激光器，长春新产业光电技术有限公司；FOTRIC 220s热像仪，苏州科努德电子科技有限公司；Alpha 2-4 LSC basic冷冻干燥机，德国CHRIST；LRH-100恒温细菌培养箱，上海叶拓；SW-CJ-2F超净工作台，素净安泰；YCT-50A恒温摇床，上海捷呈实验仪器有限公司。

1.2 抗菌水凝胶的制备

1.2.1 Cy7标记的抗菌肽的合成

Cy7标记的抗菌肽GLFVDK(-Cy7)GKRWWKWWRRG-PLGVRGC(AMP-Cy7)是以ChemMatrix树脂为载体，采用Fmoc固相合成法合成的[11-12]。该条多肽的侧链引入了一个Mtt保护的赖氨酸氨基酸，多肽序列合成完毕后用切割液(1%的TFA溶于DCM中，并且添加5%的TIS)切除Mtt保护基团，暴露出氨基，称取5倍多肽当量的Cy7和等摩尔比的EDC，DIEA，HOBt在DMF溶液中搅拌反应过夜，即可将Cy7标记其上。使用裂解液(TFA∶EDT∶TIS∶H2O=94∶2.5∶1∶2.5)浸泡树脂3 h将多肽剥离，用冰乙醚沉淀后高速离心分离，洗涤三次。将最终的沉淀溶解于超纯水中，采用半制备高效液相色谱纯化，收集HPLC产物峰，冻干后得蓝绿色抗菌肽粉末，其准确性由LC-MS确定。

1.2.2 纳米金星的合成

实验开始前，用现配制的王水(HNO3∶HCl=1∶3)彻底洗涤所有需要使用的容器，之后用双蒸水反复冲洗。完成准备后，取1 g AuCl4·4H2O放入洗涤过的玻璃瓶中，加入100 mL超纯水中，避光下涡旋，得到浓度为40 mM的氯金酸溶液，避光4 ℃保存。称取3 g HEPES粉末，转移至梨形瓶，使用5 mL移液器精确加入超纯水85.2 mL，超声下搅拌溶解，备用。称取0.4 g NaOH，转移至15 mL离心管，加入10 mL超纯水，振荡涡旋后得到浓度为1 mol/L的NaOH溶液，从中取出4.8 mL于HEPES溶液中，搅拌均匀。使用经过校正的pH计对该混合溶液进行酸碱度测定，使用剩余NaOH溶液可少量逐滴加入，将溶液pH调至7.4左右，得到HEPES缓冲液。

精准吸取浓度为40 mM的氯金酸溶液1 350 μL，迅速滴加至上述HEPES缓冲液中，使用玻璃棒快速搅匀约5 s，溶液澄清透明，避光下静置。45 min后反应结束，溶液呈紫黑色，分装至离心管中，使用高速冷冻离心机，在室温下13 000 rpm离心15 min。黑色沉淀附着于离心管壁上，除去淡蓝色透明上清液，用超纯水反复吹打并超声，将附着在管壁的沉淀重悬，配平后在室温下13 000 rpm离心15 min。重复操作2次，以完全去除HEPES缓冲液残留。最终用5 mL超纯水重悬各离心管中沉淀，收集后用超纯水定容至10 mL，得到0.2 nM AuNs水溶液，避光下放入4 ℃冰箱密封保存。

1.2.3 AuNS-PEG-AMP(APA)的制备

APA是利用Au-S配位键的形成制得的。简而言之，将500 μL的PEG-SH(1 mg/mL)加入10 mL AuNS(0.2 nM)中，室温反应30 min后加入500 μL的AMP-Cy7(28 μM)，避光反应12 h。反应液离心后弃去上清，沉淀分散在超纯水中进行进一步的应用。

1.2.4 复合抗菌凝胶(APA-F127)的制备

取不同浓度的APA水溶液2 mL，加入0.6 g的F127粉末充分搅拌，然后放置4 ℃冰箱中溶解过夜。由于F127具有显著的温敏性，即可随温度的变化进行溶胶—凝胶的相互转换，因此将F127与APA的混合溶液置于室温中即可形成复合抗菌水凝胶。

1.2.5 AuNs-PEG-AMPs纳米颗粒水合粒径和Zeta电位测定

启动马尔文粒度仪，预热30 min。准备经超纯水稀释后的AuNs、AuNs-PEG、AuNs-PEG-AMPs各2 mL，备用。超纯水冲洗粒径皿3次，吸取1 mL AuNs水溶液，放入粒径皿中，轻微摇晃均匀，使纳米颗粒完全分散，注意避免因摇晃产生气泡，影响检测结果。确认粒径皿摆放方向，扣上皿盖，小心插入样品槽。运行Malvern工作站，测量温度25 ℃，测量3次取平均值。重复上述操作，完成其余样品粒径测定。

超纯水冲洗电位皿3次，吸取1 mL AuNs水溶液，放入电位皿中，避免皿中产生气泡，插好皿塞，确认好电位皿摆放方向、外部电极无液体、电位皿中液面平衡。小心插入样品槽。运行Malvern工作站，测量温度25 ℃，平衡时间2 min，测量3次取平均值，重复上述操作，完成其余样品Zeta电位测定。

1.2.6 AuNs-PEG-AMPs-Gel载药系统流变学表征

准备浓度为2 nM的AuNs-PEG-AMPs-Gel 1 mL，启动流变仪，将温度测定范围设置为0～50 ℃，频率1 Hz，加热速率为1 ℃/min。测量AuNs-PEG-AMPs-Gel在各温度下的的储能模量和损耗模量，以判断成胶温度，表征前AuNs-PEG-AMPs-Gel至少静置24 h。

1.3 抗菌水凝胶的抗菌活性

1.3.1 细菌培养

选择金黄色葡萄球菌(ATCC6538，G+)来检测水凝胶的体外抗菌性能。将细菌在TSB中摇晃12 h(37 ℃，250 rpm)，传代后进入对数生长期。通过测定菌液在600 nm处的光密度(OD)值来确定其浓度，当OD600为0.1时，金黄色葡萄球菌的对应浓度分别为2 × 108CFU/mL。

1.3.2 最小抑菌浓度(MIC)的测定

将200 μL含有不同浓度APA的水凝胶溶液添加到48孔板的孔中，在37 ℃下形成水凝胶。将10 μL预热的细菌悬液(108CFU/mL)缓慢添加到水凝胶表面，PBS处理组作为阴性对照。在37 ℃下孵育4 h后，将预热的TSB溶液添加到每个孔中重悬细菌，稀释适当倍数后接种于TSA平板上，最后置于细菌培养箱中37 ℃孵育16 h。

1.3.3 生物膜的抑制

将处于对数生长期的金黄色葡萄球菌和含有1 nM APA的水凝胶加入96孔板中，光照组使用1.8 W/cm2的近红外光照射6 min，PBS处理组为阴性对照，37 ℃共孵育48 h。结束后弃去上层培养基，用PBS轻轻洗去悬浮的细菌后加入1%(V/V)结晶紫乙醇溶液反应20 min。最后用PBS洗去多余的结晶紫溶液，底部残留物用80%乙醇溶液溶解，测定其在590 nm处的吸光度。根据各组的吸光度评价生物膜的抑制效果。

2 结果与讨论

2.1 APA纳米粒子的制备与表征

图1(a)给出了AMP-Cy7的质谱图，[M+4H]4+的m/z计算值为758.0，实测值为757.8；[M+5H]5+的m/z计算值为606.6，实测值为606.2，确认了AMP-Cy7的成功合成。图1(b)的透射电镜图显示了AuNS的形貌，其呈多个尖峰的星形结构，分散均匀，粒径主要维持在(50±2.1)nm，具有较高的比表面积。图1(c)的Zeta电位显示，AuNS表面带负电荷，数值在-35 mV左右；当跟PEG-SH和AMP-Cy7结合后，导致其表面电荷中和与反转，证明了APA纳米粒子的成功合成。图1(d)的紫外可见光谱中AuNS的局域表面等离子共振(LSPR)峰在与PEG-SH和AMP-Cy7结合后发生了红移，同样证明了APA纳米粒子的成功制备。

图1 APA纳米粒子构成组分的表征数据图Fig.1 Characterization of the constituent components of APA nanoparticles

2.2 APA-F127复合抗菌水凝胶的合成及表征

图2 抗菌水凝胶的物理性质研究Fig.2 Physical properties of antibacterial hydrogels

流变学表征结果可以判断温敏型AuNs-PEG-AMPs-Gel载药系统的成胶温度。结果显示，当温度大于20 ℃后，储能模量大于损耗模量，此时AuNs-PEG-AMPs-Gel载药系统发生弹性形变，载药系统变为固态凝胶。而弹性模量小于储能模量时，AuNs-PEG-AMPs-Gel载药系统发生粘性形变，载药系统为液态(图2)。此结果表明，温敏型AuNs-PEG-AMPs-Gel载药系统制备成功，在20 ℃时，有形变为固态水凝胶趋势，成胶温度低于人体表面温度(约37 ℃)。

2.3 APA-F127复合抗菌水凝胶的杀菌性能研究

如图3(a)所示，抗菌水凝胶对金黄色葡萄球菌的杀菌活性与包裹的APA浓度呈正相关，当APA的浓度仅为1 nM时便可杀灭50%的细菌，显示出极其优异的杀菌性能。此外，图3(b)是抗菌水凝胶及附加光照后对金黄色葡萄球菌生物膜抑制的结晶紫染色图像及相应吸光度。从图中可以看出，1 nM APA浓度下的抗菌水凝胶对金黄色葡萄球菌生物膜也有显著的抑制效果，并且在附加近红外光照后进一步提升，最终抑制率高达80%以上。综上所述，抗菌水凝胶具有优良的体外杀菌活性，并可通过近红外光的照射协同杀菌，起到很好的抑菌效果。

图3 抗菌水凝胶的体外抗菌活性Fig.3 In vitro antibacterial activity of antibacterial hydrogels

3 结 论

本实验将APA纳米颗粒装载到F127水凝胶中，通过抗菌肽固有杀菌活性和光热剂在近红外光照射下产生的热量对细菌进行双重杀伤，在体外抗菌实验中显示出优异的杀菌效果，证明我们成功构建了光热增强的水凝胶杀菌平台，并且作为伤口敷料具有进一步的临床转换价值。该实验结合了有机化学、微生物学、分析化学、生物化学、仪器与分析等专业基础理论知识，对学生的实验操作技能和所学知识的运用提出了较高要求。在实验实施的过程中，学生展现出饱满的科研热情和良好的团队凝聚力，通过查阅文献和反复实验得到了理想的数据结果，深化所学知识的同时也提升了科研热情。此创新实验对学生综合素质的培养具有良好的促进作用。