基于调控NF-κB信号通路探讨白藜芦醇影响DCs成熟对恢复COPD小鼠Th17/Treg平衡的作用及机制

唐斌 李秋根 李凡 尹祖安 陈婷 凌友亮 黄丹

(江西省人民医院(南昌医学院第一附属医院) 1呼吸与危重症医学科,江西 南昌 330006;2急诊科;3南昌大学第二附属医院麻醉科)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)发病机制复杂,T淋巴细胞、树突细胞(DCs)等都参与了COPD的发病过程。其中辅助T细胞(Th)17和调节性T细胞(Treg)是一种相关联的淋巴细胞亚群,二者均来源于CD4+T细胞,但功能上是相互拮抗的。Th17/Treg失衡是COPD发展的关键点之一,Th17/Treg比值失衡向Th17方向偏移,促进COPD进展〔1,2〕。DCs成熟与Th17/Treg平衡有关,成熟DCs(mDCs)可以造成CD4+T细胞向Th17分化,而未成熟的DCs(iDCs)则可诱导Treg分化。在COPD中,iDCs水平下调,mDCs水平上升。iDCs介导免疫耐受,导致Treg升高,Th17降低〔3〕。研究揭示白藜芦醇通过抑制核因子(NF)-κB活性,减少NF-κB亚基RelA/P65表达或减少P65核移位而发挥抗炎作用〔4〕。然而,尚不清楚白藜芦醇在调控NF-κB信号通路而影响DCs功能状态中的作用及其与COPD中Th17/Treg平衡的可能关系,本研究旨在探讨白藜芦醇影响DCs成熟对恢复COPD小鼠Th17/Treg平衡的作用与机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及其分组 36只SPF C57BL/6雌性野生型小鼠,6～8周龄,体质量20～25 g,从南昌大学实验动物科学中心采购。饲养温度25～26 ℃,60%～70%相对湿度,投喂块状食物,小鼠饮水自由,垫料每周更换2次。采用随机数字表法分成健康对照组、COPD组和白藜芦醇干预组各12只。本研究取得医院伦理委员会批准,所有动物饲养及实验操作符合相关管理要求准则及实验动物伦理要求。

1.2动物模型制备 COPD小鼠模型制作方法:采用香烟烟雾刺激和气道注射脂多糖(LPS)制备COPD模型,分别于第1、15天气道内注射LPS溶液(200 μg/200 μl);第2～28天(除第15天外)在造模箱(玻璃制成,25 cm×35 cm×80 cm,盒子顶部有一个直径约2 cm的通气孔,盒子中间有两排从下往上的铁网,铁网之间放置并点燃香烟中被动吸烟(2次/d,12支/次),同一天两次被动吸烟的间隔时间为2 h,COPD 组注射LPS当日呼吸新鲜空气,不给予上述烟雾刺激处理。健康对照组:正常饲养,不予上述处理。白藜芦醇干预组:造模方法同COPD组,同时给予25 mg/kg白藜芦醇灌胃。其余两组与白藜芦醇同等剂量生理盐水灌胃。

1.3动物处理及外周血、支气管肺泡灌洗液(BALF)、肺组织标本收集及骨髓源性DCs的提取 (1)外周血:在实验的第28天,小鼠清醒时采集内眦静脉丛1 ml血液,采集的外周血样本立即放入肝素抗凝管中,待用于流式细胞术检测。(2)BALF及肺组织:各组小鼠末次激发24 h后,10%水合氯醛400 mg/kg ip麻醉,分离气管,用0.3 ml磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗右肺3次,收集BALF, 4 ℃ 12 000 r/min离心10 min,将上清液置于-80 ℃冰箱中保存以备检测,用1 ml PBS重悬细胞。取重悬液10 μl进行涂片染色、炎症细胞计数、分类。切取左肺门附近肺组织,厚度2～3 mm,灭菌后用0.9%氯化钠注射液消毒清洗血渍,用10%甲醛固定。此外,取一些新鲜的肺组织,在液氮中速冻后,置于灭菌的PE管中,置于-80 ℃冰箱冷冻备用。(3)骨髓源性DCs:采用脱颈法对小鼠实施处死,分离并去除股骨、胫骨骨骺端。用PBS冲洗骨髓,用离心机1 000 r/min离心5 min,丢弃上清,将PBS再次混匀底部的细胞沉淀,以混匀的细胞液与淋巴细胞分离液一起以2 000 r/min离心20 min。提取骨髓基底细胞层,PBS洗涤3次,留取备用。

1.4流式细胞术检测外周血、BALF中DCs成熟标志物及Th17/Treg比值 采用直接标记的流式抗体,采用双色荧光标记法测定外周血、BALF中DCs成熟标志物〔人类主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅱ、CD80、CD86水平〕及Th17/Treg比值,详细步骤见试剂盒说明书。检测是在相同的仪器参数下进行的,激发波长488 nm,每个样本收集20 000个细胞,Cell Quest Plot软件分析数据,包括外周血检测单个核细胞中CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表达量,有细胞中CD80、CD86、及MHC-Ⅱ表达量均以百分率(%)表示,比较DCs各因子测定管减去阴性对照管的百分率。用CD4+CD25+Foxp3+标志物鉴定Treg细胞,用CD3+CD8-白细胞介素(IL)-17A+标志物鉴定Th17细胞。用FSCAN流式细胞仪测定Th17/Treg比值,并用BD-FACS-Diva 软件进行分析。

1.5病理标本的制备及染色 用10%甲醛固定的新鲜肺组织,进行常规的脱水,透明,用蜡浸渍,制备蜡块,染色,并在光学显微镜下观察。

1.6逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测 DCs中 NF-κB 的表达 先用Trizol试剂提取3组 DCs的总RNA,(根据试剂盒说明书操作);然后应用TaKaRa公司逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA,然后对其进行进一步检测。

1.7统计学方法 采用SPSS25.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1肺组织病理结构 健康对照组支气管壁光滑完整,肺组织、气道及血管周围未发现炎症细胞浸润。COPD组气道壁被炎性细胞浸润,细支气管显示出纤毛倒伏、缩短、粘连,其上皮黏液杯状细胞增生,明显出现肺气肿,可见形成的肺大泡。白藜芦醇干预组与COPD组相比有所改善,炎症细胞浸润减少,肺气肿和肺大泡也有所改善。见图1。

2.2外周血、BALF中DCs成熟标志物及Th17/Treg比值 3组外周血及BALF中CD80、CD86、TH17/Treg水平比较:COPD组>白藜芦醇干预组>健康对照组(均P<0.05);3组外周血及BALF中MHC-Ⅱ水平比较:健康对照组>白藜芦醇干预组>COPD组(均P<0.05)。见表1。

图1 各组气道炎症的病理改变(HE染色,×20)

表1 各组外周血和BALF中CD80、CD86、MHC-Ⅱ水平及Th17/Treg比较

3 讨 论

COPD的发病机制复杂,自身免疫机制也在一定程度上参与了COPD的发生发展,T淋巴细胞介导的自身免疫在COPD发病中发挥重要作用,特别是Th17和Treg及其比值〔5,6〕。DCs是体内最重要的抗原递呈细胞(APCs),DCs在诱导Th17/Treg细胞轴的免疫平衡中起关键作用,从而在COPD的炎症过程中起关键作用。不同的刺激可以诱导不同的DCs成熟状态,从而刺激T细胞不同的功能状态,有研究报道,髓iDCs表面缺乏CD40、B7等黏附辅助分子,导致T细胞失活和低反应,并可诱导Treg产生,呈现显著的免疫耐受〔7〕。NF-κB是决定DCs功能状态的关键因素〔8〕。相关研究表明,NF-κB参与细胞增殖和分化、衰老、死亡、黏附和迁移〔9〕。Yu等〔10〕报道细胞外腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)激活P2x7R-NF-κB通路促进小鼠髓源性DCs成熟。韩旭〔11〕研究表明,阻断 LPS-TLR4/NF-κB 信号传导通路,可抑制DCs成熟,继而增加其耐受性。白藜芦醇是一种多酚类植物抗毒素,它广泛分布在自然界,具有调节免疫、抗氧化、抗炎、自由基清除、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等功能〔12〕。对COPD、支气管哮喘、肺纤维化、肺动脉高压等有抗炎、抗氧化作用〔13〕。白藜芦醇可负向调节NF-κB、转录激活蛋白-1等信号通路,它可减轻COPD炎症细胞的激活和炎症因子如IL-8和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的释放〔14〕。本研究结果提示,白藜芦醇可抑制NF-κB信号通路而阻断DCs成熟,从而恢复COPD小鼠Th17/Treg的平衡,继而延缓COPD小鼠气道炎症的进展。有文献报道,白藜芦醇可以通过负调节NF-κB的表达来调节抗氧化酶的活性〔15〕。Mohammadpou等〔16〕研究表明,呼吸道合胞病毒(RSV)可能通过RelA和c-Jun基因调控降低NF-κB和转录激活因子(AP)-1活性。Buttari等〔17〕报道,白藜芦醇体外预处理人单核细胞衍生的DCs可防止DCs成熟,其通过免疫化学和细胞荧光分析发现白藜芦醇对DCs表面成熟标志物上调有抑制作用,还抑制DCs中的促炎细胞因子表达、同种异体刺激能力上调、丝裂原活化蛋白激酶和NF-κB活化。本研究说明,白藜芦醇能够通过抑制NF-κB信号通路而阻断DCs成熟从而恢复COPD小鼠Th17/Treg的平衡,在延缓COPD小鼠气道炎症的发生发展中起重要作用。