浙江省金华市柑橘黄龙病检测及柑橘木虱分布情况调查

刘顺民, 吕佳, 杜丹超, 蒲占湑, 张利平, 朱莉, 黄振东, 陈国庆, 鹿连明

(浙江省农业科学院 浙江省柑橘研究所, 浙江 台州 318020)

中国是全世界最大的柑橘生产国, 种植面积达27 701.533 hm2, 产量达4 365.57 万t[1]。柑橘产业是浙江省农业主导产业之一, 柑橘种植品种丰富, 栽培历史悠久[2]; 近年来, 随着浙江柑橘产业不断发展壮大的同时, 也面临着诸多不利发展因素的制约, 柑橘黄龙病是威胁柑橘产业健康发展的首要因素[3]。1956 年柑橘黄龙病首次在广东潮汕地区被报道发生[4], 随后在亚洲、非洲、大洋洲和美洲陆续有相关报道, 截至目前该病已经扩散蔓延至全世界40 多个国家。

柑橘黄龙病菌是一种仅寄生于韧皮部组织内的革兰氏阴性细菌, 目前还不能通过人工培养[5]。1995 年由学者GARNIER 等[6]提议统一命名为柑橘黄龙病, 之后又根据细菌学名的国际命名法将黄龙病菌分为亚洲柑橘黄龙病菌 (CandidatusLiberibacter asiatum )、非 洲 柑 橘 黄 龙 病 菌(CandidatusLiberibacter africanum) 和美洲柑橘黄龙病菌 (CandidatusLiberibacter americanum)[7-12]。研究表明, 柑橘黄龙病菌形态学上存在长条形和圆形两种类型, 两者致病性无较大差异, 寄主主要是柑橘属及其芸香科柑橘亚科近缘属植物。除柑橘属植物外, 枳、金柑、黄皮、九里香、澳指檬、木苹果、酒饼簕等近缘属植物上均有检出黄龙病菌的报道[13-14], 并能通过人为接种方式感染长春花、菟丝子、烟草和番茄等非芸香科植物[15-18]。不同的是, 黄龙病亚洲种和黄龙病美洲种都属于耐热型,在27 ～32 ℃发病症状明显, 其田间传播有相同且唯一的昆虫媒介: 柑橘木虱。而黄龙病非洲种属于热敏型, 一般在22 ～24 ℃症状明显, 在高于27 ℃时症状逐渐消失, 且媒介昆虫为非洲木虱[19]。在中国, 柑橘黄龙病是毁灭性病害之一, 也是国内检验检疫性病害之一。在柑橘各个生长期都能感染黄龙病, 感病性难易不均, 发病后可造成树冠稀疏,植株矮化。最典型的症状为叶片斑驳型黄化, 在秋梢上表现最为明显, 果实上表现为畸形变小且转色不均的 “红鼻子果”, 造成果实商品率降低, 严重时可导致整棵树黄化枯死, 带来巨大的经济损失[20-21]。

20 世纪80 年代初年首次在浙江温州平阳县发现柑橘黄龙病, 之后调查发现柑橘黄龙病零星分布在浙江省温州市南部地区, 且伴随有柑橘木虱的发生[22-23]。全球气候变暖, 为柑橘木虱向北迁移活动提供了有利的气候条件, 加上当下苗木市场管理混乱和基层检测能力不足等人为因素, 导致柑橘黄龙病病害分布呈逐渐向北扩大的趋势。在21 世纪初黄龙病疫情普查中, 研究人员在除了温州市之外的台州、丽水两市也发现了柑橘黄龙病, 并呈现迅速爆发的趋势。其传播媒介柑橘木虱的活动范围现已遍布温州、台州、丽水、宁波等地[24], 基于当下柑橘黄龙疫区逐渐向北扩展和柑橘木虱向北迁移的现状, 故开展了此次针对浙江省衢州市和金华市两地区柑橘黄龙病及柑橘木虱发生情况调查, 通过TaqMan 探针法和实时荧光定量PCR (real-time PCR) 方法对柑橘样品中的柑橘黄龙病菌进行检测, 以掌握两地黄龙病发生情况, 为两地及周边地区针对柑橘黄龙病及柑橘木虱防控提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2022 年9 月采集于金华市地区下辖的兰溪市、婺城区、金东区、武义县及永康市境内30 个柑橘果园, 通过症状识别的方法对柑橘黄龙病进行初步调查, 每个果园内采集3 ～5 株表现为疑似黄龙病的柑橘树, 按每株采集5 ～10 片老熟黄化叶片作为一个样品, 共计210 个样品按照来源分类整理。

1.2 试剂与引物

植物基因组DNA 提取试剂盒购自杭州新景生物试剂开发有限公司; Real-time PCR 试剂Premix EXTaq(Probe qPCR) 购自宝生物工程 (大连)有限公司 (TaKaRa)。

Real-time PCR 引 物 为 HLBas: 5′-TCGAGC GCGTATGCAATACG-3′ 和 HLBr: 5′-GCGTTATCC CGTAGAAAAAGGTAG-3′, 探 针 为 HLBP: 5′-AGACGGGTGAGTAACGCG-3′ ( 5′ FAM 标 记, 3′BHQ-1 标记), 16S rDNA 序列下游引物OI2C: 5′-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3′, 以上引物和探针均由TaKaRa 公司合成。

1.3 样品DNA 提取

每个样品称取0.1 g 叶脉组织剪碎置于2 mL无菌离心管中, 放入5 mm 研磨珠, 随后将离心管置于-40 ℃冷冻研磨机内研磨成粉末, 研磨频率80 Hz, 研磨时间为200 s, 中断10 s, 重复运行3次。使用杭州新景生物试剂开发有限公司植物基因组DNA 提取试剂盒进行DNA 提取, 具体操作如下: 充分研磨后加入500 μL、65 ℃预热的Buffer PL, 充分混匀后置于65 ℃水浴锅内10 min, 期间每隔2 ～3 min 摇晃离心管以帮助DNA 释放; 加入350 μL Buffer K, 盖上管盖, 用力摇晃15 s, 涡旋振荡30 s。13 000 r·min-1离心5 min; 离心后将上清液倒入核酸纯化柱 (核酸纯化柱置于2 mL 离心管中) 中, 盖上管盖, 12 000 r·min-1离心30 s; 弃2 mL 离心管中的滤液, 将核酸纯化柱置于2 mL 离心管中, 在核酸纯化柱中加入500 μL Buffer WA (Buffer WA 中已经加入无水乙醇), 盖上管盖, 12 000 r·min-1离心30 s; 弃2 mL 离心管中的滤液, 将核酸纯化柱置于2 mL 离心管中, 在核酸纯化柱中加入600 μL Buffer WB (Buffer WB中已经加入无水乙醇), 盖上管盖, 12 000 r·min-1离心30 s; 弃2 mL 离心管中的滤液, 将核酸纯化柱置于2 mL 离心管中, 盖上管盖, 14 000 r·min-1离心1 min; 弃2 mL 离心管, 将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 mL 离心管中, 在纯化柱中加入100 ～200 μL、65 ℃预热的Buffer TE, 盖上管盖, 室温静置2 min, 12 000 r·min-1离心30 s, 弃纯化柱, 洗脱的DNA 可储存在-20 ℃备用。

1.4 实时荧光定量PCR 检测

采用TaqMan 探针法进行实时荧光定量PCR 检测, 特异性引物为HLBas/HLBr, 探针为HLBP,以黄龙病阳性样品的DNA 为阳性对照, 柑橘无病毒苗木样品为阴性对照, 以ddH2O 为空白对照。Real-time PCR 检测反应体系为20 μL, 包含2×Premix ExTaq10 μL, 250 nmol·L-1的上下游引物各1 μL, 150 nmol·L-1探针1 μL, 待测样品DNA 1 μL, 无菌双蒸水6 μL; 反应在Bio-Rad CFX96 PCR 仪上进行, 扩增程序如下: 95 ℃预变性2 min, 95 ℃ 10 s, 58 ℃ 30 s, 40 个循环。反应结束后, 根据实时荧光定量PCR 所检测样品的Ct值, 分析样品是否感染有柑橘黄龙病菌。

1.5 黄龙病菌的PCR 片段克隆与序列分析

黄龙病菌16S rDNA 序列的特异性引物为HLBas/OI2C, 上 游 引 物 HLBas: 5′-TCGAGCGC GTATGCAATACG-3′, 下游引 物OI2C: 5′-GCCTCG CGACTTCGCAACCCAT-3′, 以 黄 龙 病 阳 性 样 品DNA 为模板, 用上述引物进行PCR 扩增, 获得的目的片段经过电泳, 用凝胶回收试剂盒 (TaKaRa,日本) 回收纯化后, 将目的片段与pMD19-T 载体(TaKaRa, 日本) 连接, 通过热转化将连接产物转化Mach1-T1 Phage Resistant 菌株感受态细胞。通过挑取单菌落经PCR 筛选后, 送上海生物工程有限公司测序分析。

1.6 柑橘黄龙病媒介昆虫发生情况调查

兰溪市、婺城区、金东区、永康市和武义县是金华市下辖主要柑橘种植区县, 调查这5 个县市区内柑橘果园柑橘木虱发生情况并记录果园的管理水平、柑橘木虱发生率 (发生率为有木虱发生的果园数除以调查的总果园数)、成虫虫口密度 (成虫虫口密度为成虫个数除以调查总株数) 和有虫株率 (有虫株率为有木虱发生的株数除以调查的总株数)。

2 结果与分析

2.1 柑橘黄龙病菌的检测

本次在金华市5 个县市区的16 个乡镇街道共采集210 份样品, 检测出13 份样品携带黄龙病菌,黄龙病菌检出率达6.2%, 详情见表1。其中永康市唐先镇样品检出率最高, 达20.0%, 此外武义县白洋街道, 婺城区洋埠镇、罗埠镇, 永康市花街镇样品检出率均超过10.0%, 以上街道、乡镇均属于柑橘黄龙病发生较为严重的区域。

表1 黄龙病菌实时荧光定量PCR 检测结果

2.2 柑橘黄龙病菌测序分析比对

以HLBas、OI2C 为上下游引物, 分别用金华市兰溪市、婺城区、武义县和永康市4 个柑橘黄龙病阳性样品DNA 为模板进行PCR 扩增, 电泳结果显示扩增出1 171 bp 目的条带, 如图1 所示。通过对扩增产物纯化回收与克隆转化, 挑选出阳性克隆子, 将阳性克隆子送上海生物工程有限公司测序分析, 将所得序列在NCBI 中与基因库所有序列进行比对分析, 经BLAST 结果表明, 所得序列均为亚洲柑橘黄龙病菌, 相似性均在99.5%以上。

图1 HLBas/OI2C 引物PCR 扩增电泳图

2.3 金华市各县区柑橘黄龙病媒介昆虫发生情况

从表2 可以看出, 此次调查金华市下辖的兰溪市、婺城区、金东区、武义县及永康市均有柑橘木虱的发生, 从调查数据可得出, 以上几个县市柑橘木虱发生情况不容乐观, 特别是永康市境内柑橘木虱发生率最高, 达到83.3%。兰溪市柑橘木虱发生密度最大, 柑橘木虱成虫口密度为21.0 头·株-1, 有虫株率为41.9%。

表2 金华市各县区柑橘木虱发生情况

2.4 不同管理水平下柑橘黄龙病媒介昆虫发生情况

调查发现, 在管理果园和半失管 (失管) 果园均有柑橘木虱的发生分布, 在调查的30 个果园中, 有7 个果园为半失管 (失管) 状态, 在半失管 (失管) 果园内柑橘木虱发生各项指标均高于管理果园内柑橘木虱的发生情况, 详见表3。通过SPSS 软件分析, 柑橘木虱发生危害情况与果园管理情况呈显著相关性, 相关系数为0.99。

表3 不同管理情况下柑橘木虱发生情况

2.5 黄龙病与柑橘木虱发生的区域分析

金华市位于浙江省中西部, 为浙江省主要柑橘种植区之一, 从本次柑橘黄龙病检测和柑橘木虱发生分布调查结果来看, 金华市下辖的兰溪市、婺城区、金东区、武义县及永康市均有柑橘木虱的发生 (图2)。同时在以上地区均检测到柑橘黄龙病的发生, 说明以上几个县市区为柑橘黄龙病和柑橘木虱发生重叠区域。相关部门应该加强与金华市兰溪市和婺城区相邻的周边地区柑橘黄龙病和柑橘木虱的监测, 防止柑橘黄龙病病情外溢至衢州市境内。

3 结论与讨论

柑橘黄龙病是危害柑橘的主要病害之一, 对柑橘产业造成严重性威胁, 该病的传播媒介昆虫是柑橘木虱, 柑橘木虱在取食柑橘黄龙病病株后可终生带毒, 且传毒效率高[25]。本次研究通过TaqMan 探针法和实时荧光定量PCR 法检测金华市柑橘黄龙病发生情况。从检测结果上看, 柑橘黄龙病在金华市兰溪市、婺城区、武义县和永康市均有不同程度发生, 而在金东区未检测到柑橘黄龙病; 从柑橘木虱的发生调查中可看出, 柑橘木虱在金华市兰溪市、婺城区、金东区、武义县、永康市均有不同程度的发生, 特别是金华市永康市柑橘木虱发生率达到83.3%, 且所调查的县市区柑橘木虱发生率均在50%以上, 属于柑橘木虱发生严重区域。

根据上述结果笔者认为, 金华市柑橘黄龙病检出率高可能与以下几点有关: 首先金华市地处丽水市、台州市这类柑橘黄龙病疫区周边, 加上金华市境内柑橘苗木市场混乱无秩序, 导致未经过检验检疫的柑橘苗木、接穗从疫区内流入, 特别是近几年由于苗木市场需求大, 大量引进杂柑类品种, 这类杂柑带病严重, 加快了柑橘黄龙病在金华市内的传播速度。其次是大部分种植户对柑橘黄龙病的认识和防范意识不足, 对果园缺乏科学有效的管理, 在面对柑橘黄龙病侵染的病株时不能进行有效判断和识别, 无法及时挖除病株, 导致黄龙病得以快速传播。最后是随着全球气候变暖, 冬季平均气温上升显著以及金华市内柑橘苗木基地不同柑橘品种间放梢时间不同等环境条件给柑橘木虱提供了生存和繁殖空间, 进一步为柑橘木虱大范围侵染提供了有利条件。从调查结果来看, 在金华地区有柑橘黄龙病发生的地方几乎都有柑橘木虱的发生, 当同时满足毒源、媒介昆虫这两个条件时, 就应该引起当地相关部门的重视, 制定相关的防控措施来遏制柑橘黄龙病的传播。

鉴于金华市柑橘黄龙病发生情况不容乐观, 特别是此次调查发现, 在紧邻衢州市的金华市兰溪市和金华市婺城区都有柑橘黄龙病和柑橘木虱发生,容易造成病情外溢, 应加大柑橘黄龙病的防控力度, 尤其是对全市各个柑橘主要产区柑橘黄龙病发生情况进行实时监测。同时针对柑橘木虱发生的特点, 加强栽培管理, 科学合理促进嫩梢增厚老熟,缩短易受木虱侵害的嫩梢期, 并且集中在发梢期加强药剂防治, 完善统防统治的防控体系。在病区与非病区种植杉木、玉米等高秆植物, 阻碍风的流动性, 从而起到一定阻隔作用, 对木虱会有良好的控制效果, 建立防护林案例在福建永春地区防控黄龙病已取得显著成效。

调查中还发现, 在失管或半失管的果园内, 柑橘树势弱, 抽梢次数参差不一, 这类果园内柑橘木虱发生率高于管理果园内柑橘木虱发生率。这说明在有人为干预管理的情况下, 果园内柑橘木虱发生危害情况得到一定控制, 但无法杜绝果园内柑橘木虱的发生, 出现该情况可能是由于距离半失管或失管果园过近, 或是在防治柑橘木虱的时候没有进行统防统治, 柑橘木虱往返迁飞, 无法真正做到柑橘木虱的防控管理。相关部门应该做好统筹工作, 将一些失管果园进行集中处理, 才能更好地清除虫源, 切断柑橘黄龙病传播链条。

柑橘黄龙病严重危害柑橘产业, 如何建立长效的柑橘黄龙病防控机制是当下的主要内容之一, 除加强规范柑橘苗木市场和防控柑橘木虱之外, 地方政府、农技部门应提高重视大力宣传, 加大资金投入和相关人才培养, 同时转变种植户的固有种植观念和管理水平, 树立 “统防统治” 观念, 才能将黄龙病防控有效推进。