分子标记辅助选择与花药培养相结合选育携带抗白叶枯病基因Xa39 的水稻恢复系

张馨月, 钱秋, 陈婕, 董俊杰, 李友发, 汪庆, 富昊伟*

(1.嘉兴市农业科学研究院, 浙江 嘉兴 314016; 2.无锡市哈勃生物种业技术研究院有限公司, 江苏 无锡 214100)

水稻是我国重要的粮食作物, 对保障我国粮食安全至关重要。由革兰氏阴性菌黄单孢菌水稻变种(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo) 引起的白叶枯病是危害水稻生产的重要病害之一, 具有突变性强、传播侵染速度快等特点, 一旦暴发便很难得到有效控制。该病害在我国南方稻区以及亚洲东南亚稻区经常暴发成灾,Xoo可造成水稻减产21% ～74%, 严重时甚至导致绝收。白叶枯病属于维管束病害, 使用化学药剂防治效果不理想, 还会污染环境, 破坏生态。理论和实践均表明, 培育和种植抗病品种是防治水稻白叶枯病害最经济有效的方法。

我国一直很重视水稻白叶枯病抗性育种, 利用携带广谱高效抗病基因的种质资源是培育水稻抗病新品种的基础。虽然目前已发掘的白叶枯病抗性基因有46 个[1], 但由于大多抗性基因的抗谱较窄、部分抗病基因仅具有成株期抗性, 以及来源于野生稻的抗病基因难转育等问题, 在水稻种质创新中有较大利用价值的抗性基因资源仍十分有限。20 世纪80 年代以来, 创制水稻抗白叶枯病种质利用的主流抗性基因包括Xa3、Xa4、Xa21 和Xa23[2],但因白叶枯病菌在漫长的进化过程中形成了复杂的遗传多样性, 原有抗性品种会因小种变化而抗性衰退, 难以在生产上一劳永逸。如近年来已陆续发现克服Xa4 和Xa21 的白叶枯病菌小种[3-4]。因此,需要不断创制培育携带新的抗白叶枯病基因的水稻材料。Xa39 是一个全生育期抗白叶枯病且抗谱广的显性新基因。该基因对我国和菲律宾的白叶枯病菌代表病原型和生理小种均表现出典型的超敏反应, 其中包括Xa4 的毒力菌株CV 和Xa21 的毒力菌株GV[5], 在水稻抗病育种中具有重要的应用价值。

杂交水稻大面积应用生产, 对提高我国水稻产量和维护粮食安全至关重要。杂交水稻的抗病性与其双亲的抗病性密切相关[6]。目前, “粳不籼恢”是强优势籼粳亚种间杂交稻应用最广的配组方式[7], 而籼稻相对粳稻更容易感染白叶枯病, 因此, 选育抗白叶枯病的籼型恢复系是配组选育抗白叶枯病籼粳杂交水稻新品种的重要途径。DR609是本课题组前期育成的优质广亲和恢复系, 具有矮秆、穗大、米质优等特点, 但其不抗白叶枯病。本研究以籼型恢复系DR609 和携带Xa39 的8TP139(中国农业科学院作物科学研究所提供) 为材料,通过传统杂交结合分子标记辅助选择和花药培养技术, 旨在获得具有广谱持久白叶枯病抗性的籼型恢复系, 为选育绿色安全的籼粳杂交稻提供优良亲本材料。

1 材料与方法

1.1 PCR 标记引物及方法

用于PCR 分析的DNA 分离采用十六烷基三甲基溴化铵法 (CTAB 法)[8]。选用与目标基因Xa39紧密连锁的分子标记RM26985 对各株系进行基因型筛选。PCR 引物由杭州擎科生物技术有限公司合成。引物序列为F: 5′-CACAAGACAACCTTCAAT GG-3′, R: 5′-GGCTTAGGAGCGTTTATAGG-3′。Xa39的扩增体系为20 μL: 1 μL DNA 模板, 10 μmol·L-1正、反向引物各1 μL, 10 μL 2×EasyTaqSuper Mix, 7 μL 无菌dd H2O。PCR 反应程序为: 94 ℃预变性5 min 后进入循环, 94 ℃变性1 min, 55 ℃退火45 s, 72 ℃延伸45 s, 经过35 个循环扩增后,72 ℃延伸10 min。PCR 扩增产物在3%浓度的琼脂糖凝胶上电泳分离, 分离结果用BIO-RAD 凝胶成像系统观察, 进行拍照和记录。

1.2 白叶枯病抗性鉴定

白叶枯病抗性鉴定在浙江省嘉兴市农业科学研究院古塘基地进行。试验选用来自于浙江省农业科学研究院的菌种进行水稻白叶枯病接种。在水稻孕穗—抽穗期接种剪叶, 接种采用剪叶法, 白叶枯病菌液浓度为每毫升3×108个细胞, 接种后21 d 调查和记录发病情况, 每个株系选取20 张叶片测量病斑长度和接菌叶片的长度。抗性评价标准见表1。

表1 白叶枯病的发病等级

1.3 籼型水稻抗白叶枯病恢复系的选育

以DR609 为母本与8TP139 杂交获得F1, 而后自交获得F2。从F2代开始进行白叶枯病抗性接种鉴定, 同时分单株提取叶片DNA。F3代时所选单株均用分子标记检测及接种抗性鉴定, 筛选出农艺性状优良含Xa39 基因的抗白叶枯病材料。F3代株系中选择综合农艺性状优良且携带Xa39 基因的材料进行花药培养, 对获得的花培苗进行分子标记检测, 筛选出含纯合Xa39 基因的花培苗 (DH1), 单株种植DH1, 通过田间农艺性状考察、分子标记检测及抗性鉴定, 筛选出20 个综合农艺性状优良的含纯合Xa39 基因的抗白叶枯病材料 (DH2-1 ～20), 对DH2-1 ～20 进行抗性鉴定和配合力测试,最终综合分析筛选出具有实际应用价值的携带Xa39 基因的恢复系材料 (DH3)。选育程序如图1。所有试验材料夏季和冬季分别种植在嘉兴市农业科学研究院嘉兴试验基地和海南陵水试验基地。

图1 水稻抗白叶枯病恢复系的选育流程图

1.4 恢复性比较及产量比较实验

2021 年冬季在海南陵水基地分期种植DH2-1 ～20、BT 型粳稻不育系嘉锡A, 每个DH 株系做3个重复的杂交, 共配置60 个杂交组合。2022 年夏季在嘉兴市农业科学研究院古塘基地按照随机区组设计种植60 个杂交组合, 以甬优1 540 作对照, 5月28 日播种, 6 月25 日移栽, 种植10 行, 每行6株, 单本栽, 株行距16.7 cm×18.7 cm。大田常规水肥管理, 于孕穗—抽穗期进行白叶枯病接种鉴定。记录抽穗期, 成熟后每小区取未接种的中间五株调查株高和单株有效穗数。按照单株有效穗数取未接种的3 个单株, 调查单株穗数、每穗粒数、结实率、千粒重和单株谷重。

2 结果与分析

2.1 基因型检测

利用与抗病基因Xa39 紧密连锁的分子标记RM26985[9], 对供体亲本 8TP139 与受体亲本DR609 及其F1、F2代单株进行多态性分析, 结果显示, RM26985 是共显性标记, 能区分出纯合抗病基因型和杂合抗病基因型, 可以有效应用于分子标记辅助选择 (图2 ～3)。

图2 亲本及其F1、F2 群体部分单株的Xa39 基因检测

图3 DH1 群体部分单株的Xa39 基因检测

2.2 恢复系的白叶枯病抗性鉴定

对各世代以及花药培养的单株及株系在孕穗—抽穗期进行人工接种抗性鉴定 (数据未呈现)。综合田间农艺性状、分子标记检测和抗性鉴定结果,从DH1群体中筛选得到20 份携带纯合Xa39 基因株系, 编号为DH2-1 ～20, 从表2 可以看出, DH2-1～20 株系对白叶枯病的抗性均达到了0 级或1 级水平。

表2 DH2 群体株系的白叶枯病抗性鉴定

2.3 测配组合农艺性状、产量及白叶枯病抗性表现

根据嘉锡A 与DH2-1～20 测配组合表现, 其中DH2-8 恢复力表现较好, 暂定名为嘉浙恢08。由表3 和图4 可知, 嘉锡A 与嘉浙恢08 配组得到的杂种F1株高111.3 cm, 穗长23.4 cm, 单株有效穗数8.3 个, 每穗总粒数 259.1 粒, 结实率为87.0%, 千粒重22.9 g, 单株谷重42.9 g, 携带杂合Xa39 基因, 白叶枯病抗性等级为1 级, 较对照甬优1540 单株谷重提高2.9%, 白叶枯病的抗性等级提高。

图4 嘉锡A/嘉浙恢08 杂交组合的Xa39 基因检测

表3 杂交组合及对照组合的产量性状和抗性表现

3 讨论

虽然我国水稻新品种的审定对白叶枯抗性要求不像稻瘟病一样 “一票否决”, 但由于近年来很多省份白叶枯病出现大暴发, 新品种的白叶枯病抗性逐渐引起重视。籼粳杂交稻相比杂交籼稻或杂交粳稻具有明显的产量优势及增产潜力, 其中 “粳不籼恢” 是应用最广的配组方式, 而籼稻相对粳稻更容易感染白叶枯病, 培育抗白叶枯病的籼型恢复系对提高杂交稻的白叶枯病抗性尤为重要。

白叶枯病生理小种遗传变异速度快, 传统抗病种质的创制不仅周期长而且存在很多的不确定性,难以满足生产的需要。本研究采用分子标记辅助选择、花药培养技术与田间农艺性状选择相结合, 可准确快速获得携带目标性状的纯合材料, 大大缩短了育种年限, 提高了育种效率, 节约了大量的人力、物力和成本。本试验中分子标记辅助选择获得的携带抗白叶枯病基因Xa39 的单株均能表现预期抗性效果。选育的籼型恢复系嘉浙恢08 接种鉴定结果也很理想, 并且测配的杂交种F1代也携带抗白叶枯病基因Xa39, 具有良好的产量潜力和白叶枯病抗性。表明将广谱抗白叶枯病基因Xa39 导入籼型恢复系中,在水稻育种中具有广阔的应用前景。