加味揉肝汤提取物对雏鸡急性肝损伤的缓解作用

王文佳,仇天新,丁金雪,王伟然,刘家国

(南京农业大学 动物医学学院 教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室,江苏 南京 210095)

恩诺沙星是动物专用抗菌药,在机体内代谢为环丙沙星,能够使体内转氨酶水平升高,通过影响细胞色素P450酶使药物代谢减慢[1-4],产生一定的肝毒性[5-6];恩诺沙星产生过氧化物和自由基导致氧化应激[7],降低线粒体膜电位,发生细胞凋亡[6]。人类误食有恩诺沙星蓄积的动物源食品后,也会引起人类机体发生肝脏损伤,影响人类的生命安全。恩诺沙星在杀灭革兰阴性菌例如大肠杆菌的同时,会使菌体破裂释放内毒素(脂多糖),内毒素进入血液后加重肝脏负担。有研究采用恩诺沙星联合脂多糖新型复合式诱导肝损伤模型[8-9],为集约化动物养殖过程中肝脏疾病的防治提供了依据。

芍药甘草汤,出自张仲景的《伤寒论》一书,由芍药和甘草两味中药组成,是治疗腹痛经典方剂之一[10],有调和肝脾,柔肝缓急,缓解腹痛,滋阴养血的功效。中药具有多靶点,有研究基于网络药理学发现芍药甘草汤在抗肝损伤方面有一定功效,特别是针对CYP1A2和PTGS2靶点具有诊断和治疗价值[11]。加味揉肝汤是在此方剂的基础上,遵循中医理论增加了田基黄、厚朴、茯苓、泽泻和五味子,按照一定比例煎煮制成。现代药理学有研究证实,加味揉肝汤中几味中药具有黄酮类化合物、糖类、萜类化合物、酚类化合物以及挥发油等化学成分[12],有肝脏保护的作用。

本试验采用LPS联合恩诺沙星导致肝脏损伤,用来评价加味揉肝汤提取物的临床疗效,并探究药物作用机制,以期为开发保肝药物或动物饲料添加剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂材料LPS(L2630,Sigma);恩诺沙星(SE8390,索莱宝),纯度HPLC≥98%;生理盐水;0.1 mol/L NaOH溶液;乳酸脱氢酶LDH(BC0685,索莱宝);丙二醛检测试剂盒(A003-4-1,南京建成);超氧化物歧化酶SOD检测试剂盒(A001-3-2,南京建成);过氧化氢酶CAT检测试剂盒(A007-1-1,南京建成)。

加味揉肝汤水提物(MRGD):将方剂中所有草药200 g和2 L水加入烧杯中,浸泡45 min后,大火煮沸转小火煮2 h。分离药渣和药液后,将中药残留物加入2 L水中进行第2次烹饪。将2次药液混合并浓缩至200 mL,最后进行真空冷冻干燥,获得MRGD冻干粉。

加味揉肝汤水提醇沉物/多糖(MRGDE):水提过程同上。向制备的MRGD浓缩液中添加无水乙醇至70 %的乙醇浓度。置于在4℃下沉淀,12 h后,获得的沉淀溶解在去离子水中,并通过Sevage法(正丁醇∶氯仿=1∶4)脱蛋白纯化。多糖与Sevage试剂5∶1比例混合振荡30 min后低速离心,重复3次以去除变性蛋白。最后进行真空冷冻干燥,获得MRGDE冻干粉,冻干粉溶解在纯净水中。

1.2 动物分组及处理1日龄雏鸡适应性饲养3 d后,雏鸡分4组 (n=16),分为Control组,LPS-ENR组,MRGD+LPS-ENR为复方水提物组,MRGDE+LPS-ENR为复方多糖组。第4天,除Control组雏鸡外,灌服恩诺沙星,连续3 d,剂量为20 mg/(kg·d)[13]。其中,第4天在灌服恩诺沙星前1 h,口服给予2种中药干预,按中药生药0.075 g/(kg·d),连续处理3 d;第6天恩诺沙星处理后,雏鸡腹腔注射LPS稀释液,注射剂量为0.25 mg/(kg·d)[14-15]。Control组等体积纯净水或生理盐水同样处理。LPS或生理盐水注射后,观察雏鸡一般症状,24 h采集血液及肝组织样品。

1.3 肝脏表观及组织病理学的观察剖开雏鸡腹腔,观察肝脏是否肿胀、有无出血、坏死等现象;称取雏鸡体质量和肝脏质量,记录数据。采用脏体系数来评价肝脏肿大情况,肝脏系数(g/g)=肝脏质量(g)/体质量(g)。用4 %多聚甲醛固定同一部位的肝组织,石蜡包埋,进行苏木精-伊红染色(HE),并进行病理组织学观察。

1.4 血清生化指标测定3 000 r/min离心10 min分离并收集血清,使用生化分析仪(UniCel DxC 600 Synchron,Beckman Coulter,Brea,CA)检测血清中AST、ALT、TP和ALB水平。

1.5 肝组织中氧化应激水平的检测将肝组织加入到预冷的PBS中进行匀浆,检测匀浆液中MDA的水平,以及抗氧化酶(SOD、CAT)的活性,严格按照生产商说明书进行试验操作。

1.6 免疫荧光法检测肝组织中Nrf2蛋白表达情况固定好的肝组织切片,0.01 mol/L PBS冲洗5 min,3次;除去PBS液,5% BSA室温下封闭25 min。除去封闭液,加适量的Nrf2抗体(1∶100稀释),4℃孵育过夜。PBS洗3遍后,避光加入山羊抗兔IgG-FITC(1∶200稀释),37℃ 孵育45 min;弃掉二抗,加入DAPI染液,室温15 min;PBS洗涤后,滴加防淬灭剂,封片后显微镜下观察。

1.7 RT-PCR法和Western blot法检测肝组织中抗氧化基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平RNA isolater Total RNA Extraction Reagent(R401-01,诺唯赞)提取肝组织中的RNA,使用反转录试剂盒(R233-01,诺唯赞)将RNA反转为cDNA。实时荧光定量方法检测肝组织中抗氧化基因mRNA的表达量,引物由上海捷瑞公司合成,引物序列见表1。RT-PCR的体系为10 μL,反应程序:95℃,30 s;95℃,10 s,60℃,30 s,40个循环。以GAPDH为内参,按2-ΔΔCt计算mRNA相对表达量。

使用高效RIPA(组织/细胞)裂解液(R0010,索莱宝),提取肝组织的总蛋白,全程在冰上操作。内参选用β-actin(1∶1 000,Abclonal公司),一抗蛋白Nrf2(1∶500,Proteintech公司)和CAT(1∶500,Abclonal公司)。

2 结果

2.1 发病情况描述Control组:正常采食饮水,粪便性状干燥偏湿,羽毛光亮。LPS-ENR组:偶有采食饮水,精神沉郁,粪便塘稀,羽毛脏乱,鸡群造模后有打盹萎靡不振,扎堆,站立不稳现象。MRGD+LPS-ENR组:饮水少,粪便湿度偏干,偶有粪便发黄稀便,鸡群造模后个别鸡只萎靡不振;MRGDE+LPS-ENR组:饮水少,粪便形态偏干接近正常,有个别水样粪便,鸡群扎堆现象减少,个别鸡只站立不稳。

由此可见采用LPS-ENR能够造成雏鸡发生腹泻,状态不佳,在一定程度上造成了雏鸡机体损伤。

2.2 肝脏变化剖开腹腔,暴露肝脏。发现与Control组相比,LPS-ENR组雏鸡肝脏肿大,有出血、瘀血,以及不同程度的坏死灶(图1);而中药预处理后,肝脏出血瘀血以及坏死程度均有所改善。图2和表2结果显示,LPS-ENR组的肝体系数显著高于Control组(P<0.05),表明造膜后肝脏肿大;而药物MRGD和MRGDE预处理后,药物组的肝体系数均与Control组无显著差异(P>0.05)。肝组织病理学观察结果发现(图3),LPS-ENR组的肝小叶结构不清晰,细胞核深染、碎裂,核溶解,细胞间有出血,坏死灶,炎性细胞浸润等现象;而MRGD干预后观察到肝组织中有轻微出血,肝小叶结构形态正常,无坏死灶,炎症反应降低;MRGDE干预后仍有炎性细胞浸润的现象,有轻微出血,肝小叶形态有较好的改善。

黑色箭头表示出血、坏死

黄色箭头表示坏死;红色箭头表示出血;黑色箭头表示炎性浸润

表2 雏鸡肝体系数

2.3 对肝功能生化评价指标的影响24 h后,LPS-ENR组雏鸡血清生化中AST、ALT水平较Control组有显著的升高(P<0.05),而TP、ALB水平显著性降低(P<0.05)(图4)。MRGD和MRGDE药物干预组的AST水平较LPS-ENR组有显著降低(P<0.05),ALT水平也趋于雏鸡正常组水平,但差异不显著(P>0.05)(图4A、B);LPS-ENR组与Control组相比TP水平有所下降(P>0.05),服用2种药物后TP水平也趋于正常,其中MRGDE组与LPS-ENR组差异显著(P<0.05)(图4C);24 h后LPS-ENR组的ALB水平显著低于Control组(P<0.05),口服MRGDE后,雏鸡的ALB水平明显被提升至正常水平,与LPS-ENR组差异显著(P<0.05);而MRGD组的ALB水平有轻微的改善,但仍与LPS-ENR组差异不显著(P>0.05)(图4D)。

A.ALT;B.AST;C.TP;D.ALB

2.4 对肝组织中氧化应激水平的影响图5所示为试验中雏鸡肝组织中氧化应激指标的变化。在造模24 h后,与Control组相比,LPS-ENR组能升高雏鸡肝脏中MDA的水平(P<0.05);MRGD使MDA水平降低,较LPS-ENR组差异显著(P<0.05),并且趋于Control组(P<0.05)(图5A);而MRGDE的效果不显著,MDA水平下降不明显。

同时检测雏鸡肝组织中抗氧化酶的活性,发现LPS-ENR组肝脏中抗氧化酶SOD、CAT活性较Control组均降低(P<0.05);与模型LPS-ENR组相比,2种药物组的抗氧化酶活性均有所改善,MRGD预处理后能有效升高雏鸡肝损伤后的SOD活性(P<0.05),并能够显著上调CAT的活性(P<0.05);MRGDE组的SOD活性显著高于与LPS-ENR组(P<0.05),但未升高至正常水平(图5B),CAT的活性被改善(P<0.05)(图5C)。

2.5 肝组织中Nrf2蛋白表达情况与Control组相比,LPS-ENR组肝脏的细胞中有少量Nrf2蛋白表达,荧光减少,荧光强度降低;MRGD和MRGDE干预后的雏鸡肝脏细胞中Nrf2蛋白的表达量明显增加,荧光增加(图6)。表明两种提取物的干预能够促进雏鸡肝脏组织中Nrf2蛋白表达。

2.6 对抗氧化相关基因mRNA表达水平的影响图7结果显示,在LPS-ENR造模后,雏鸡肝脏组织中的抗氧化基因Nrf2、SOD、CAT和GPX的mRNA水平表达量较Control组均显著降低(P<0.05)。与LPS-ENR组相比,药物MRGD能够显著上调SOD和GPX的mRNA相对表达量至正常(P<0.05)(图7C、D),并上调了Nrf2和CAT的mRNA相对表达量(P>0.05)(图7A、B);药物MRGDE使Nrf2和CAT的mRNA相对表达水平显著升高并趋于正常(P<0.05)(图7A、B),使SOD和GPX的mRNA表达水平升高,但差异不显著(P>0.05)(图7C、D)。

2.7 对抗氧化基因Nrf2和CAT的蛋白表达水平的影响图8结果显示,与Control组相比,LPS-ENR组的Nrf2和CAT蛋白相对表达量下调; MRGD组雏鸡肝组织中Nrf2、CAT蛋白相对表达量较LPS-ENR组显著增加(P<0.05),MRGDE组的蛋白相对表达量也被上调(P>0.05)。结果表明加味揉肝汤两种提取物能够促进肝组织中Nrf2、CAT的蛋白表达。

A.Nrf2和CAT的Western blot结果;B,C.分别为Nrf2和 CAT蛋白相对表达量

3 讨论

芍药甘草汤源于张仲景的《伤寒论》,芍药与甘草等量,临床上用于腹痛,现代研究发现其有镇痛、抗氧化等功效,本试验以芍药甘草汤为基础方,添加田基黄、五味子等中药组成的加味揉肝汤。水提法和水提醇沉法在临床实践中极为常见,也是规模化和商业化的草药加工方法。水提法也是最经典、最古老、最简单的草药制备方法,而水提醇沉法获得的多糖是草药中含量丰富的一种活性成分,它也被证明具有广泛的功能。因此,本试验借鉴现代医学的研究、药物本身的性质特点以及中医用药理论,评价了2种产物对肝脏的影响,期望对今后药物和饲料添加剂的开发有生产实践的指导意义。试验发现加味揉肝汤水提物(MRGD)和多糖提取物(MRGDE)对脂多糖联合恩诺沙星(LPS-ENR)导致的雏鸡肝脏损伤有保护作用,能降低雏鸡血清AST、ALT的水平,升高TP、ALB水平,对损伤的肝脏病理结构有一定的改善,降低肝脏肿胀程度,减少肝脏出血和坏死等,提示该方剂的两种提取物干预对肝损伤雏鸡有一定的保护作用。

有研究证实,恩诺沙星被过量或不恰当的使用会产生一定的肝毒性,危害机体的健康。恩诺沙星是动物专用抗生素用以防治细菌病的感染,在杀菌的同时造成细菌破裂释放脂多糖。脂多糖是细菌的细胞壁成分,能激活NF-κB信号通路,激活炎性因子的表达,释放NO、自由基等物质攻击细胞[16-17],导致机体发生炎症和氧化应激反应[16]。Nrf2是保护细胞免受氧化损伤的关键转录因子,当细胞发生氧化应激作用后,胞浆中的Keap1发生修饰后,其与Nrf2发生解离,Nrf2被释放后并进入细胞核与抗氧化原件(ARE)结合,从而调控编码抗氧化蛋白的上游区域[18]。Nrf2通路被激活后,调控NQO1等下游靶蛋白,促进CAT、SOD和GPX等下游蛋白的表达[19]。本试验发现,过氧化氢酶(CAT)的活性随着肝脏损伤也随之降低,CAT能够清除体内的H2O2,使细胞免受H2O2造成的氧化损伤[20]。由于脂多糖和恩诺沙星的使用,雏鸡体内的自由基过量堆积,消耗大量的CAT,使机体中CAT的含量降低。当自由基大量增加,CAT和SOD就不足以清除自由基,导致机体发生氧化损伤。而加味揉肝汤水提物和多糖成分可不同程度地提高抗氧化酶SOD和CAT的活性,降低氧化损伤评价指标MDA的水平,并且使受损伤肝脏中的Nrf2蛋白表达升高,提升Nrf2通路的抗氧化相关基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平。综上,加味揉肝汤水提物和其多糖提取物的干预通过激活Nrf2通路来提高机体的抗氧化能力,降低肝脏氧化应激程度,从而改善LPS-ENR导致的雏鸡肝损伤。但2种提取物的保护效果无明显差异,考虑到经济成本、药物作用效果、繁琐工艺等方面,需参照实际情况,是否进一步进行中药的提取加工,在畜禽养殖过程中具有理论指导意义。