粉蕉PAL家族基因的鉴定及其在逆境胁迫下的表达分析

曾 坚, 王舒婷, 周洁薇, 胡 伟, 曾力旺

(1.韶关学院广东省粤北食药资源利用与保护重点实验室/韶关学院英东生物与农业学院,广东 韶关 512005;2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南 海口 571101;3.中国热带农业科学院科技信息研究所,海南 海口 571101)

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是苯丙烷代谢途径中的关键酶,PAL广泛存在于各种植物中[1],能够将保守的L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸。在植物中,苯丙烷代谢途径是重要的次生代谢途径,它会影响植物中多种次级代谢产物合成,如类黄酮、木质素、花青素等,因此会参与植物的生长发育过程和响应多种非生物环境胁迫[2-3]。此外,PAL还是重要激素水杨酸合成途径的限速酶,因此,PAL在植物的生物胁迫过程中也发挥着重要作用[4]。在植物中,PAL通常是由小基因家族编码,最早从大麦中分离出了具有苯丙氨酸解氨酶活性的PAL[5]。目前已经在不同物种中鉴定到PAL家族基因,例如拟南芥[6]、水稻[7]、苹果[8]等。PAL家族基因影响着植物的不同生长发育过程,如拟南芥中的PAL2和PAL4在种子中表达较高,而PAL1、PAL2和PAL4在茎中表达较高[1]。在苹果中,PAL在果实发育的早期和成熟期高表达[8],表明其可能影响着果实的发育过程和最终果实的品质,这和PAL影响类黄酮和花青素等次生代谢产物的合成和含量密切相关[3]。PAL和木质素的合成密切相关,木质素对提高植株抵御干旱和病原菌侵染等逆境胁迫能力具有重要作用,在拟南芥中PAL能促进木质素的合成来增加细胞壁的厚度[6];在小麦中,TaPAL基因在根中的高表达可能提高了植株响应干旱胁迫的能力[9];在感染不同病原菌后的玉米、小麦和水稻中,PAL的表达水平都显著提高[10-12]。因此,PAL基因家族在植物的生长发育和逆境胁迫响应中都发挥不同的作用。

香蕉(Musassp.)是热带地区广泛种植的水果,也是数百万人的重要粮食。大多数可食用栽培香蕉起源于种内或种间杂交的Musaacuminata和Musabalbisiana[13]。香蕉在生长过程中会遭受到香蕉枯萎病、低温、干旱等不同逆境的影响,对香蕉的产量和最终果实品质产生重要影响[14-15]。而次级代谢产物影响着香蕉果实品质和抵抗不同逆境胁迫的能力,因此,研究香蕉中PAL家族基因种类和不同逆境处理下的表达情况具有重要意义。本研究拟从香蕉基因组中鉴定得到PAL家族基因,并研究它们的进化关系、基因结构和编码的蛋白质结构域,同时对其在不同器官、果实发育和成熟的不同阶段以及非生物/生物胁迫响应中的表达模式进行分析,以期为香蕉遗传改良提供基因资源。

1 材料与方法

1.1 材料和处理方法

粉蕉(Musa.ABB group,Pisang Awak subgroup)是一种具有良好风味的优良香蕉品种,对逆境具有很好的适应性。将粉蕉苗种植在无菌土壤塑料盆中,在生长室中培养,培养条件为温度28 ℃,相对湿度70%,光照周期16 h/8 h,光合光子通量密度200 μmol/(m2·s)。为了分析不同组织中PAL家族基因的表达,从5叶期幼苗中采集根和叶样本;为了分析果实发育过程中PAL家族基因的表达,采集开花后0 d、20 d和80 d的果实,同时收集采收后3 d和6 d的果实。用300 mmol/L NaCl或200 mmol/L甘露醇连续灌溉香蕉幼苗(5叶期)7 d,分别作为盐胁迫处理和渗透胁迫处理。将5叶期香蕉幼苗置于4 ℃生长室22 h作为低温胁迫处理。采集处理后叶片样本(每个处理5 g)进行非生物处理的PAL家族基因表达分析。将香蕉幼苗根部(5叶期)浸泡在每1 ml含有1×106个香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)分生孢子的孢子悬液中2 h。将香蕉幼苗根部(5叶期)浸入无菌蒸馏水中2 h作为对照。所有接种植株移栽到无菌土壤塑料盆中,在生长室中培养,培养条件为:温度28 ℃,相对湿度70%,光照周期16 h/8 h,光合光子通量密度200 μmol/(m2·s)。培养2 d后,采集根系样品进行PAL家族基因表达分析。每个样本包含2个生物重复样本。

1.2 香蕉PAL家族基因的鉴定及系统发育分析

利用从PF00221中下载的HMMs模型,从香蕉A基因中搜索得到MaPAL基因序列,然后利用得到的MaPAL基因序列构建新的HMMs模型,利用新HMMs模型从基因组中搜索鉴定MaPAL基因。使用保守结构域数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和PFAM数据库 (http://pfam.sanger.ac.uk/)来验证鉴定得到的MaPAL家族基因。利用下载得到的AtPAL和OsPAL基因编码的氨基酸序列,以MEGA-X中的MUSCLE方法进行序列比对,使用Neighbor-joining法构建系统发育树,Bootstrap值设置为1 000。采用Wolf Psort网站(https://wolfpsort.hgc.jp/)进行亚细胞定位预测。

1.3 香蕉PAL家族基因结构及编码蛋白质特性

通过ExPASy数据库(http://expasy.org/)对相对分子质量和等电点等理化性质进行预测。利用MEME软件和InterProScan数据库对蛋白结构域序列进行鉴定。采用GSDS数据库(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)对基因结构进行分析。

1.4 转录组分析

RNA测序中的RNA提取、文库制备和测序等工作由美吉生物技术有限公司(中国上海)完成。进行RNA-seq分析样本的收集过程参考之前的研究[16]。每个样本包含2个生物重复序列。测序平台为Illumina GAII(Illumina,San Diego,CA,USA)。FASTX(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)和FastQC(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)用于删除接头序列和低质量序列。通过Tophat V.2.0.10将粉蕉样本clean read与香蕉基因组进行比对[17],使用Cufflinks进行转录组组装[18]。基因的表达值使用FPKM值表示。使用DEGseq工具鉴定差异表达基因。

2 结果

2.1 MaPAL家族基因的鉴定

根据MaPAL基因编码的蛋白质保守结构域构建HMM模型,总共从香蕉A基因组中鉴定到8个MaPAL基因,分别命名为MaPAL1～MaPAL8(表1)。香蕉MaPAL家族基因中MaPAL6编码的氨基酸序列最长,为782个氨基酸残基,MaPAL7编码的氨基酸序列最短,为700个氨基酸残基。MaPAL1～MaPAL8编码的蛋白质相对分子质量为7.596×104～8.595×104,等电点为5.76～6.23,MaPAL2基因编码的蛋白质等电点最低,MaPAL3基因编码的蛋白质等电点最高。亚细胞定位预测结果显示,MaPAL1～MaPAL8编码的蛋白质都定位于细胞质内。为了研究香蕉MaPAL家族基因的进化关系,分别下载了拟南芥和水稻中的AtPAL和OsPAL家族基因编码的氨基酸序列(表1),采用NJ法构建了系统发育树。结果如图1所示,所有PAL基因可以分成两类,除MaPAL6基因外,所有香蕉PAL基因和拟南芥及水稻的PAL基因聚在一起,而MaPAL6基因则单独成一支,说明MaPAL6基因和水稻、拟南芥PAL基因之间的同源性低。

图1 香蕉、拟南芥和水稻的PAL家族基因系统进化树

表1 MaPAL家族基因信息

2.2 MaPAL家族基因结构及编码蛋白质结构域分析

为了研究香蕉MaPAL家族基因可能的功能和其结构差异,利用MEME数据库从MaPAL家族基因编码的蛋白质中鉴定到10个保守基序,并利用InterPro数据库对10个保守基序分别进行鉴定,结果(表2)显示,Motif1～Motif10都含有结构域IPR001106,该结构域功能为芳香族氨基酸裂解酶。所有的MaPAL家族基因编码的蛋白质都呈现出类似的基序组成(图2),MaPAL6缺少Motif10。进一步对MaPAL家族基因的结构进行分析,MaPAL6只有1个内含子,而其他7个基因包含2个内含子(图3)。蛋白质结构域和基因结构的分析结果表明,同一类有类似的基因结构,这也和系统发育树中MaPAL6基因单独成一类的结果一致。

图2 MaPAL家族基因编码蛋白质的保守基序分布

图3 MaPAL家族基因的结构分析

表2 保守基序Motif1～Motif10的注释

2.3 粉蕉不同组织MaPAL家族基因的表达

对MaPAL家族基因在粉蕉不同组织的表达情况进行分析。结果(图4)表明,除MaPAL5外,其他7个MaPAL基因在根中都高表达(FPKM>5);在叶片中,MaPAL1、MaPAL4、MaPAL6、MaPAL7这4个基因高表达,在果实中则只有MaPAL4高表达。MaPAL家族基因中只有MaPAL4基因在根、叶和果实中高表达,在根中高表达的MaPAL家族基因最多。

图4 粉蕉不同组织MaPAL家族基因的表达分析

2.4 粉蕉果实不同发育阶段MaPAL家族基因的表达

为研究MaPAL家族基因在果实发育阶段的功能,对该家族基因在粉蕉果实不同发育阶段中的表达情况进行了分析。如图5所示,在果实发育早期(花后0 d和20 d),只有MaPAL3和MaPAL4基因呈现出高表达(FPKM>5);在果实发育后期(花后80 d、采收后3 d、收获后6 d),MaPAL4、MaPAL6、MaPAL8基因高表达。MaPAL2和MaPAL5基因在果实发育后期没有表达,可能不参与该过程;而MaPAL4基因在果实发育的所有阶段都呈现出高表达,推测该基因可能在果实发育过程中发挥了作用。

图5 粉蕉果实发育和成熟阶段的MaPAL基因表达分析

2.5 不同逆境下MaPAL家族基因的表达

为研究MaPAL家族基因的功能,本研究分析了在不同逆境条件下该家族基因的表达情况。根据转录组数据,除了MaPAL5基因外,其他MaPAL家族基因在逆境下都有响应表达(图6)。在低温胁迫下,3个基因(MaPAL1、MaPAL4、MaPAL7)表现出上调,MaPAL2基因表现出下调;在渗透胁迫下,4个基因(MaPAL1、MaPAL3、MaPAL4、MaPAL7)表现出上调,没有基因呈现出下调;在盐胁迫下,2个基因(MaPAL1和MaPAL7)表现出上调,没有基因呈现出下调;在Foc4侵染下,2个基因(MaPAL2和MaPAL8)表现出下调,没有基因呈现出上调。在这些响应的MaPAL家族基因中,MaPAL1和MaPAL7基因在3种非生物胁迫下都表现出上调,MaPAL4基因在低温和渗透胁迫下都表现出上调,表明这3个MaPAL基因在粉蕉的非生物胁迫响应中发挥了作用。在低温和渗透胁迫下,粉蕉中的MaPAL基因相比巴西蕉明显受到更显著的诱导[19],表明此时MaPAL基因在粉蕉中受诱导的程度更高。

Foc4:香蕉枯萎病菌4号生理小种。

3 讨论

香蕉是一种重要的热带和亚热带水果和粮食作物,在全球130多个国家都有栽培[20-24]。与其他作物相比,香蕉的研究进展较慢[25]。次生代谢物在植物的生长发育和生物/非生物胁迫的响应中起着重要作用[26]。而PAL是苯丙烷代谢途径的限速酶,也影响着木质素、类黄酮、花青素等多种重要次级代谢物的合成[2-3]。本研究从香蕉基因组中鉴定出8个PAL基因,根据系统发育关系将香蕉MaPAL家族基因分为两大类。MaPAL基因结构及其编码蛋白质的保守结构域也证明了这些基因属于PAL家族基因。MaPAL家族基因编码的氨基酸序列中都含有Motif5,Motif5中包含高度保守的亚甲基咪唑酮结构(Ala-Gly-Ser,MIO)。在遗传进化关系上,MaPAL6基因被单独分为一个亚类,这个结果也和其他研究结果[27]相一致。蛋白质保守结构域和基因结构的分析也验证了香蕉MaPAL家族基因的鉴定和分组。在拟南芥和水稻中的PAL基因数量分别是4个和9个[28],在香蕉中的数量是8个,这表明PAL蛋白属于小基因家族基因编码的蛋白质。

香蕉果实的品质很大程度上取决于它的发育和成熟过程[13]。次级代谢物的生产和含量对果实的成熟和品质具有重要影响,PAL对花青素和类黄酮等物质的生物合成起着关键作用,PAL在苹果和葡萄中都和果实的发育密切相关[8]。在本研究中,不同MaPAL基因在不同的果实发育阶段表现出不同的表达模式,如MaPAL3和MaPAL4基因只在果实发育早期表现出高表达,而MaPAL4基因则在果实发育的所有阶段都呈现出高表达,表明这些基因在果实发育和成熟过程中可能起着重要作用。在巴西蕉中,MaPAL4基因也在果实发育的所有阶段都呈现出高表达,但几乎所有MaPAL基因(除MaPAL1外)在花后0～20 d都表现出高表达[19],这表明不同香蕉品种中的MaPAL基因在果实发育阶段可能具有不同的功能。

香蕉对枯萎病菌、盐、干旱或寒冷等胁迫因素敏感,容易造成产量的减少和果实品质的降低[14-15]。类黄酮和花青素等物质能够清除活性氧,提高植物的抗氧化能力,而PAL基因和类黄酮和花青素等物质的合成相关。因此植物在遭受逆境威胁时,PAL基因的表达往往发生变化。如黄瓜和番茄中的PAL基因在非生物逆境胁迫时被诱导,表达水平提高[29-30]。本研究也发现MaPAL基因表达受到非生物胁迫诱导或抑制,其中MaPAL1和MaPAL72个基因在低温、渗透、盐胁迫中都被显著诱导,表明MaPAL基因可能在香蕉对非生物胁迫的响应中起着重要的作用。但不同香蕉品种中的PAL基因对非生物胁迫的响应可能存在差异。例如,杨会晓等[19]发现巴西蕉中PAL基因的表达也会受到非生物逆境胁迫的诱导。比较了粉蕉和巴西蕉中受非生物胁迫诱导的PAL基因情况后发现,两个品种中受到显著诱导的PAL基因数目基本相同,然而在粉蕉中,受到低温和渗透胁迫诱导的PAL基因的表达水平要高于巴西蕉。有研究结果表明,粉蕉在非生物逆境胁迫下的耐受性比巴西蕉更强[25]。这些结果表明粉蕉中的PAL基因显著受非生物逆境胁迫诱导可能与其较强的非生物胁迫抗性有关。香蕉的抗病性也是一个非常重要的农艺性状,特别是香蕉枯萎病严重影响着香蕉的产量和品质。在拟南芥中,pal突变体表现出对香蕉枯萎病易感[31]。粉蕉作为重要的香蕉品种也易受到枯萎病的影响[16]。在本研究中,MaPAL2和MaPAL8基因的表达显著受到Foc4侵染的抑制,表明这2个基因可能参与了响应Foc4侵染过程。有研究结果表明,酚类物质参与了植物对病菌侵染的抵抗过程,可以通过抑制PAL基因的表达来减少次生代谢物的产生,提高植物抵抗病菌侵染的能力[32],这也说明MaPAL基因可能在香蕉抗枯萎病中也发挥着作用。

4 结论

本研究从香蕉基因组中鉴定到8个PAL基因,并对它们的系统进化关系、基因结构、编码的蛋白质结构域进行了分析。表达分析结果显示,MaPAL基因参与香蕉的发育、成熟和对生物/非生物胁迫的响应。本研究结果表明,MaPAL4基因在所有果实发育和成熟阶段都表现出高表达。MaPAL1和MaPAL7基因可能对非生物胁迫响应,MaPAL2和MaPAL8基因在Foc4侵染时表达被明显抑制,可能响应Foc4病菌的侵染。和巴西蕉相比,MaPAL基因在粉蕉中被低温和渗透胁迫诱导的水平更高。