太原市某三甲医院非呼吸道标本分离的高毒力肺炎克雷伯菌流行病学调查

王瑞雪,王海如,李 浩,杨志宁

(1山西白求恩医院检验科,太原 030032;2山西医科大学第一医院检验科;3山西省心血管病医院检验科;*通讯作者,E-mail:mrexcel@yeah.net)

高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae, hvKP)是经典肺炎克雷伯菌(classicalKlebsiellapneumoniae, cKP)的高毒力变种,近几十年临床感染率不断上升[1,2]。hvKP不仅是社区获得性肺炎的重要病原体,还可以引起人体多种部位的单独感染或共感染,涉及临床科室众多,表现复杂多样。然而由于人们对hvKP及其相关疾病认识不足,往往导致漏诊、误诊或延迟诊断,引起严重的临床后果[3,4]。目前,hvKP发病机制尚不明确,更倾向于是宿主、病原体以及宿主和病原体相互作用的综合结果[5]。更为棘手的是,近年来随着高毒力和耐药性的共同进化,尤其是碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯杆菌(carbapenem-resistant hypervirulentKlebsiellapneumoniae, CR-hvKP)的出现,使hvKP的治疗成为临床面临的巨大挑战[6,7]。为了进一步提高人们对非呼吸道hvKP感染相关疾病的认识,提高诊疗水平,本研究将从临床感染特点、细菌耐药性、高毒力荚膜多糖血清分型及分子分型方面对山西白求恩医院非呼吸道标本分离的hvKP进行综合调查和分析。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

171株非呼吸道样本分离的肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae, KP)来自山西白求恩医院2021年10月至2022年12月住院患者血液、脓液、穿刺液、伤口拭子及及清洁中段尿样本,去除同一患者相同部位重复分离样本。

1.2 分组及主要分析指标

分离到的菌株如果携带毒力基因iucA及prmpA/prmpA2则纳入hvKP组,其余菌株纳入cKP组。分析指标包括两组病例的感染部位、感染类型、年龄、性别、基础疾病(糖尿病、肿瘤)、血清白蛋白水平,以及菌株耐药性和高毒力荚膜多糖血清型(K1、K2、K5、K20、K54和K57)分布。采用多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)对hvKP进行分子分型。

1.3 患者临床资料获取

患者人口学资料、临床数据通过查阅患者电子病例及实验室信息系统((laboratory information system, LIS)系统获得。本次研究得到山西白求恩医院医学伦理委员会审查批准(批准文件号:YXLL-2019-057)。

1.4 菌株鉴定及耐药性检测

采用MALDI-TOF MS(德国Bruker公司)对分离菌进行鉴定,得分≥8则视为可靠的鉴定结果。使用纸片扩散法(K-B法)对所有菌株进行了药物敏感性检测。药敏结果按照2021年美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)M100-S31进行结果判读。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853由卫生部临床检验中心赠送。

1.5 毒力基因及高毒力荚膜多糖血清型检测

采用PCR扩增方法检测菌株高毒力基因(iucA、prmpA和prmpA2)以及高毒力荚膜血清型(K1、K2、K5、K20、K54和K57)。扩增引物、体系和扩增条件参考文献[8,9]。

1.6 多位点序列分析(multilocus sequence typing,MLST)

根据MLST网站(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers-used/)提供的7个管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB及tonB)扩增引物及扩增条件,分别扩增每株菌的7个管家基因,经测序后将测序结果提交到https://bigsdb.pasteur.fr/中进行比对,获得每株菌的ST分型。管家基因扩增引物、测序引物的合成及测序服务均由上海生工公司提供。

1.7 统计学分析

应用SPSS 22.0软件进行统计学分析。组间比较采用χ2检验、连续校正χ2检验或Fisher’s确切概率法;采用二分类logistic回归筛选hvKP宿主易感因素;以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌株及病例收集

本研究共收集了171例菌株,分别来自血液标本55例(32.16%),脓液标本21例(12.28%),穿刺液标本29例(16.96%),伤口拭子21例(12.28%),尿液标本45例(26.32%)。经确认后得到hvKP 65株,cKP 106株。在收集的病例中,男性患者99例,女性患者72例;最小年龄3个月,最大年龄91岁。其中0～20岁患者8例,平均(8.2±3.5)岁;20～40岁患者24例,平均(31.2±9.3)岁;40～60岁患者62例,平均(50.1±5.6)岁;≥60岁患者77例,平均(77.6±9.8)岁。

2.2 非呼吸道标本分离的hvKP感染部位分布特点

卡方检验结果提示,引起肝脓肿、脓毒血症、其他部位脓肿及腹部感染的患者以hvKP引起的更多。hvKP在这4种感染部位具有分布优势(均P<0.05);cKP在尿路感染中具有分布优势(P=0.004)。同时结果表明,hvKP主要参与社区获得性感染(P<0.001),cKP主要参与医院获得性感染(P<0.001,见表1)。

2.3 非呼吸道标本分离hvKP耐药性分析

目前该医院非呼吸道分离的hvKP对多种常见抗菌药物耐药率保持在3.08%～18.46%之间。其中阿米卡星和妥布霉素耐药率最低(分别为3.08%和4.62%),环丙沙星和头孢曲松耐药率最高(分别为18.46%和13.85%)。在65株hvKP中检出4株CR-hvKP,分离率为6.15%。经卡方检验,除阿米卡星外,hvKP对其他所测抗菌药物的耐药率均显著低于cKP组,差异具有统计学意义(均P<0.05,见表2)。

表2 非呼吸道标本分离的hvKP耐药性分析 株(%)

2.4 非呼吸道标本分离的hvKP宿主易感因素分析

二元logistic回归表明,患者血清ALB水平<28.6 g/L是非呼吸道hvKP感染独立危险因素(OR=2.832,95%CI为1.207～6.646,P=0.017)。年龄、性别、糖尿病、肿瘤与hvKP感染相关性不强(均P>0.05,见表3)。

表3 非呼吸道标本分离hvKP宿主易感性二分类logistic回归分析 株(%)

2.5 非呼吸道标本分离的hvKP高毒力荚膜多糖血清分型

由表4可见,高毒力荚膜多糖血清型K1、K2是该医院非呼吸道标本分离的hvKP的主要流行血清型,分别占hvKP总量的52.31%及21.54%。经卡方检验,二者在hvKP组中的检出率显著高于cKP组,差异均具有统计学意义(P<0.001)。高毒力荚膜多糖血清型K57、K54、K5、K20在hvKP中检出率较低分别为4.62%,3.08%,1.54%及1.54%,在两组之间差异不具有统计学意义(均P<0.05)。

表4 非呼吸道标本分离hvKP高毒力荚膜多糖血清分型分析 株(%)

2.6 非呼吸道分离hvKP的MLST结果分析

本研究共筛选到非呼吸道感染的hvKP 65株,经MLST分为18个ST型,其中ST23为33株,占50.77%;ST65及ST86各5株,分别占7.70%;ST11为3株,占4.62%;ST29、ST218、ST380、ST592、ST1049各2株,分别占3.08%;ST25、ST314、ST375、ST412、ST420、ST833、ST1265、ST1557、ST2280各1株,分别占1.54%。7个管家基因扩增片段电泳图见图1。将65株hvKP对应的7个管家基因序列号进行整理,上传网址https://online.phyloviz.net/index,绘制最小生成树(minimum spanning tree, MST)(见图2)。该医院非呼吸道标本分离的hvKP,除外2个单独型ST11和ST2880,其他克隆均以ST23型为中心进行演化,发现的4株CR-hvKP分别属于ST1049、ST833、ST11和ST65,与ST23型管家基因差异数量多,亲缘关系远。

图1 hvKP 7个管家基因琼脂糖凝胶电泳图

不同颜色表示不同分群;连线之间的数值表示管家基因差异数量

2.7 非呼吸道标本分离的ST23型与非ST23型hvKP高毒力荚膜多糖血清型分布

将65株hvKP分为ST23型和非ST23型,进一步探讨ST23型hvKP高毒力荚膜多糖血清型的分布特点。卡方检验结果显示,K1血清型在ST23型hvKP存在优势分布(P<0.001),K2血清型在非ST23型hvKP中存在优势分布(P<0.001),K2血清型主要对应ST65型(35.71%,5/14)和ST86型(28.57%,4/14),K5、K20、K54、K57和K其他型在两组中的分布差异无统计学意义(均P>0.05,见表5)。

表5 非呼吸道标本分离ST23型与非ST23型hvKP高毒力荚膜多糖血清型分布 株(%)

2.8 非呼吸道标本分离的ST23型与非ST23型hvKP耐药性分析

ST23型hvKP对临床常用抗菌药物环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、头孢他啶、美罗培南以及亚胺培南的耐药率均低于非ST23型,但差异均未达到统计学意义(均P>0.05)。头孢曲松在ST23型hvKP中耐药率要高于非ST23型(P=0.027,见表6)。

表6 非呼吸道标本分离的ST23型与非ST23型hvKP耐药性分析 株(%)

3 讨论

hvKP是近些年来备受人们关注的一种病原微生物,最早由我国台湾学者提出,是化脓性肝脓肿的主要病原体。在临床上hvKP可经血流播散感染,引起脑膜炎、脑炎、内源性眼内炎、坏死性筋膜炎等特殊部位感染,导致严重的临床后果。相关研究表明,该菌在感染部位、感染人群、传播途径、生物学特征以及耐药性等方面均与cKP存在显著的差异[10,11]。然而由于hvKP定义尚不统一,同时亦缺乏简单可靠的实验室检测手段,致使hvKP流行病学数据相对缺乏,在太原市还未有相关的调查报告。由于hvKP的高毒力来源于携带的特异性毒力基因[12,13],相关文献表明毒力基因iucA联合prmpA2或prmpA可以很好体现hvKP的特征[1,5,14],故本研究用于定义hvKP进行流行病学调查。

研究结果显示,该医院非呼吸道标本分离hvKP主要引起CAI,仅有27.69%的hvKP参与HAI的发生,但在医院环境下hvKP很容易获得耐药性的突破,成为临床治疗中棘手的问题。因此,很有必要对医院环境中hvKP进行检测,避免此类菌株在医院环境内的传播。除泌尿系统感染外,其他部位感染均与hvKP有密切关系。尿路感染一般认为与病原微生物的逆行感染有关,hvKP则以血流播散进行感染,可能是造成这种现象的主要原因。血清ALB是人体营养状态的重要指标。本研究发现,血清ALB<28.6 g/L的患者更容易遭受hvKP的侵袭,其风险是血清ALB>34.7 g/L宿主的2.8倍。然而,2019年Liu等[5]在中国老年人群hvKP感染特征研究中发现,较好营养状态的宿主更容易发生hvKP感染,这与本研究得到的结果不一致。对于机体营养状态与hvKP感染的关系,可能还需要更细致的年龄分层以及前瞻性研究去揭示二者之间的内在联系。

hvKP耐药性调查结果表明,现阶段该医院非呼吸道标本分离的hvKP对临床常见抗菌药物耐药性处于较低水平,除阿米卡星外,均明显低于cKP。hvKP通常被认为不容易获得耐药性,可能的机制为菌株在获得高毒力质粒时,就丢失了耐药性质粒。学者们最初认为高毒力和高耐药性不会出现在同一菌株中,但随着高毒力和高耐药的共同进化,hvKP的耐药性也日趋严峻。2015年我国首次报道了CR-hvKP,在随后几年内CR-hvKP检出率逐渐增高[15],现在该医院非呼吸道分离的hvKP对碳青霉烯类抗菌药物耐药率达到6.15%,是不可忽视的。近年来,以Aerobactin为靶向抗毒力治疗的研究,有望最大限度地减少细菌选择性耐药,成为解决这一问题的新型途径[16,17]。

大量研究表明,K1、K2血清型与hvKP高度相关[1,18],本研究亦得出相同的结果。同时K1、K2血清型共占该医院非呼吸道标本分离的hvKP的70%以上,占有绝对优势。而其他高毒力血清型未发现与hvKP存在相关性,可能由于检出率低,还需要进一步扩大样本含量进行检验,以获得更准确的结果。MLST结果显示,ST23型为该医院非呼吸道标本分离hvKP主要克隆群,与K1血清型高度相关。与非ST23型hvKP相比,ST23型hvKP更容易获得头孢曲松的耐药,机制尚不清楚。发现的4株CR-hvKP均不属于ST23型,并与ST23型存在较远的亲缘关系,推测ST23型可能更不容易获得碳青霉烯耐药表型。

本研究亦存在诸多不足之处,首先本研究纳入菌株数量有限,未能进行更详细分层去明确不同感染部位hvKP耐药性、高毒力荚膜多糖血清型、遗传背景否存在差异。其次,虽然毒力基因iucA联合prmpA2或prmpA可以很好体现hvKP的特征,但对hvKP的定义仍然需要动物模型的进一步验证。在今后研究中将不断完善实验设计,获得更详尽的研究数据。

综上所述,本研究表明,该医院非呼吸道分离的hvKP主要引起社区获得性感染,容易侵犯多个部位形成脓肿(包括肝脓肿)、脓毒血症及腹部感染,很少引起泌尿系统感染。提高宿主血清ALB水平可能有益于hvKP感染的预防。目前hvKP对临床常用抗菌药物耐药率保持在较低水平。ST23是其主要分子型别,K1、K2荚膜多糖血清型是其主要血清流行型别。