血液免疫项目ELISA 法检测中采用EDTA-K2 抗凝剂、枸橼酸-枸橼酸钠抗凝剂的作用研究

高攀 张耀东 肖波涛 邓伟

根据血站基本标准、血站管理办法等方式, 采集患者血液后进行各项检测, 例如抗-HIV、HBsAg、抗-HCV、抗-TP ELISA 法检测, 检测时各个项目分别采用两个不同的厂家试剂［1］, 国内采供血机构常规采用三种双孔复检模式, 主要有双孔复检血袋上的辫血、双孔复检留样抗凝试管血、同时复检抗凝试管血和辫血, 最终检测结果要经过双孔复检对ELISA 法初检结果的样本进行确认。根据各项研究显示, ELISA法检测全自动酶疫分析系统为国内采供血机构所广泛使用, 在每次血液采集完毕后要留样, 采血留样按规定要用抗凝血, 抗凝剂主要采用乙二胺四乙酸(EDTA)、肝素抗凝剂［2］。本项目在研究过程中采用EDTA-K2、抗凝试管血与辫血同时做复检, 同一个献血者同次采血中发现辫血与抗凝试管血的结果出现不同, 经过摸索实验, 改用枸橼酸-枸橼酸钠抗凝剂, 并进行比较实验［3］。因此, 本次研究对血液免疫项目ELISA 法检测中采用EDTA-K2抗凝剂、枸橼酸-枸橼酸钠抗凝剂的作用进行分析。

1 材料与方法

1.1 材 料 收 集本 中 心2017 年8 月～2021 年9 月无偿献血者48689 份样本, 首先按常规采集凝固血, 然后吸取部分血样分别用EDTA-K2抗凝剂和枸橼酸-枸橼酸钠抗凝剂抗凝。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器 试剂：采用新创和万泰公司生产的抗-HIV 试剂、抗-HCV 试剂、HBsAg、抗-TP 试剂；达安的HBV 基因扩增试剂。仪器：瑞士Hamilton FAME 全自动免疫分析系统及STAR、AT 全自动加样仪；赛默飞Q5 PCR 扩增仪。

1.2.2 样本处理与检测 吸取血样5 ml 分别加入到装有EDTA-K2抗凝管(含EDTA-K25 mg/m1 血样)和枸橼酸钠(48 mg/ml 血样)-枸橼酸(1.7 mg/ml 血样)的抗凝管内颠倒混匀8～10 次, 待血液凝固后离心分离血清, 分别用新创和万泰的ELISA 试剂同时进行抗-HIV、抗-HCV、HBsAg 及抗-TP 检测［4］, 对检测结果样品的吸光度(S)/标准的吸光度(CO)>1 判定为阳性。将EDTA-K2抗凝剂改用枸橼酸-枸橼酸钠抗凝剂, 将两种阳性样本采取HBV-PCR 法进行复检, 复检样本为采样血袋上的血辫, 由辫血进行HBV-PCR 扩增确定最终结果［5］。

1.3 观察指标 统计不同厂家两种抗凝血液样本的阳性标本数量, 分析辫血复检结果。

2 结果

新创厂家生产的EDTA-K2抗凝检出抗-HIV 阳性71 例(0.15%), 抗-HCV 阳性628 例(1.29%), HBsAg 阳性784 例(1.61%), 抗-TP 阳性72 例(0.15%)；枸橼酸-枸橼酸钠抗凝检出抗-HIV 阳性57 例(0.12%), 抗-HCV阳性414 例(0.85%), HBsAg 阳性652 例(1.34%), 抗-TP阳性44 例(0.09%)。万泰厂家生产的EDTA-K2抗凝检出抗-HIV 阳性65 例(0.13%), 抗-HCV 阳性511 例(1.05%), HBsAg 阳性721 例(1.48%), 抗-TP 阳性72 例(0.15%)；枸橼酸-枸橼酸钠抗凝检出抗-HIV 阳性56 例(0.12%), 抗-HCV 阳性467 例(0.96%), HBsAg 阳性623 例(1.28%), 抗-TP 阳性47 例(0.10%)。见表1。将EDTA-K2抗凝剂改用枸橼酸-枸橼酸钠抗凝剂后,对所有阳性样本采取HBsAg 做PCR 复检阳性率, 新创、万泰阳性检出率分别降到了1.35%(657/48689)和1.33%(647/48689)。

表1 不同厂家ELISA 法检测两种抗凝血液样本的阳性标本数量分析［n(%)］

3 讨论

本研究中ELISA 法检测是基于抗原抗体反应, 高浓度抗原、抗体拖带等因素造成检验结果产生假阳性,或者仅采用抗凝试管血的情况下, 因为抗凝剂的干扰也会导致假阳性结果的出现。仅采用辫血或抗凝试管血报告结果, 相同血型间交叉留样造成干扰的问题在采血过程中没有办法避免, 这样就不能及时查找原因和发现问题, 从而发生阳性样本漏检的情况［6,7］。对阳性样本辫血进行复检, 有研究表明辫血实际上归类为血清, 辫血储存时可能会混入少许ACD 保存液, 枸橼酸-枸橼酸钠为ACD 保存液成分之一。目前市场上的检验试剂显示血清和血浆都可以适用, 但在实际工作中普遍发现检测结果还是有明显差异性, 例如在复检时无论是单做辫血检测还是单做抗凝试管血检测, 由于抗凝剂的干扰和影响, 可能抗凝试管血与辫血混入的抗凝剂并不一致, 导致无法得到真实结果, 可见在检验过程中选择适宜抗凝剂及采用正确的复检模式非常必要［8,9］。

本研究中采用两个厂家试剂分别采用ELISA 法检测抗-HIV、抗-HCV、HBsAg、抗-TP, 结果显示EDTA-K2抗凝剂对同一厂家不同项目试剂都出现干扰问题, 但两者没有明显差异［10］, 对同一厂家不同项目试剂, 枸橼酸-枸橼酸钠抗凝剂没有产生明显干扰。以往研究证实, 采用EDTA-K2抗凝剂会干扰抗-TP ELISA 法检测产生假阳性结果［11］, 综合各方面数据分析得知, EDTA-K2对血液HBsAg、抗-TP、抗-HCV、抗-HIV 检测结果都产生明显干扰, 其中以抗-TP、抗-HIV 表现尤为突出；对HBsAg、抗-HCV, 枸橼酸-枸橼酸钠抗凝剂产生的干扰明显很少。不同抗凝剂对ELISA 法的检测结果影响较大［12］。经统计相关报告,抗凝剂EDTA-K2改用枸橼酸-枸橼酸钠后的重复反应性结果中, 抗凝试管血与辫血结果不一致的情况明显减少, 因此对上述情况需要进一步积累样本量、扩大统计数据进行分析。用ELISA 法检测, 其影响测定结果的因素较多, 主要有标本因素、试剂因素、操作因素等, 在研究中主要讨论标本因素中抗凝剂对ELISA法检测结果的影响。在本次研究中, 这两种方式具有显著差异, 原因是抗原和抗体反应的结构基础在抗凝剂的抗凝过程中没有受到影响, 由于抗体实际上是免疫球蛋白, 抗体与特异性抗原发生反应的结构基础就是免疫球蛋白的可变区中氨基酸排列顺序呈高度变异性［11, 13］。

本次研究结果显示, EDTA-K2改用枸橼酸-枸橼酸钠抗凝剂后, 通过统计复检结果显示EDTA-K2抗凝试管血结果与复检辫血的阳性率明显降低, 而采用枸橼酸-枸橼酸钠抗凝剂阳性率变化不明显, 表明EDTA-K2抗凝剂对ELISA 法检测结果的影响比枸橼酸-枸橼酸钠抗凝剂的干扰更显著。

综上所述, EDTA-K2 抗凝剂对ELISA 法检测结果的影响较枸橼酸-枸橼酸钠抗凝剂的干扰更明显。