固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定小麦中6 种真菌毒素＊

章 豪 陈山乔 江潇潇 吴银良 朱 勇 陈 国

(宁波市农业科学研究院，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（宁波），浙江宁波 315040)

0 引言

真菌毒素是由真菌天然生成的次生代谢物[1]。真菌毒素种类繁多，可污染多种水果、谷物和粮食[2]。由于具有较高的化学稳定性且可耐受不同形式的分解，许多此类物质都具有致癌性、雌激素活性和毒性作用[3]。真菌毒素一直属于欧洲食品和饲料快速预警系统(RASFF)中通报的最高风险类别，它们在慢性饮食风险因素中位居榜首，优先级高于合成污染物、植物毒素、食品添加剂或农药残留[4]。因此，全世界出台了多种法规，规定了特定真菌毒素的允许限值[5]。

世界上许多国家均在进行毒性、发生率和消费数据以及经济和政治方面的全面风险评估后，对常见真菌毒素实行了管制[6]。例如，欧盟委员会法规No.1881/2006（及后续修正案）规定了不同食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2、伏马菌素B1 和B2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和曲霉毒素A 的最高允许浓度(MPL)，并为T-2 和HT-2 毒素设定了指导限值[7]。粮谷被视为真菌毒素污染的高风险商品，摄取的粮谷仅含ppb (μg/kg)浓度的真菌毒素就有可能引发严重疾病[8]。EFSA 的最新科学意见将雪腐镰刀菌烯醇的每日可耐受摄入量(TDI)确定为每日每kg 体重1.2μg，其最高平均浓度通常见于燕麦、玉米、大麦和小麦产品中[9]。2018 年，RASFF 门户网站发布了25份有关谷物中严重真菌毒素污染的通报[10]。

农产品中小麦、大米和玉米等是最易受到污染的谷物，因此也是监测的重点[11]。这些谷物中有许多天然成分都是UPLC-MS/MS 分析的干扰物[12]。采用直通式净化方法开发出一种简单快速的样品前处理方案和UPLC-MS/MS 分析方法，以小麦为例分析了6 种真菌毒素。该方法简单、快速、有效，能满足多种粮谷中真菌毒素的检测需要。

1 试验资料

1.1 仪器、试剂与材料

美国Waters 公司UPLC XevoTMTQ-MS 超高效液相色谱-串联质谱仪，德国IKA 公司Vortex Genie 3 漩涡振荡器，德国Sigma 公司低温高速离心机。

德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司真菌毒素标准品：15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷、HT-2、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、杂色曲霉毒素，甲酸（色谱纯）等。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制

分别称取（精确到0.1mg）适量6 种真菌毒素的标准品，乙腈溶解，然后配制1g/L 标准储备液，-20℃温度下保存。吸取标准储备液1mL，然后置于100mL 的容量瓶内，乙腈稀释。配制混合标准储备液10mg/L 后，-20℃温度下保存。

1.2.2 样品处理

50mL 离心管中加小麦样品2.00g，水2mL，涡旋振荡1min 后加乙腈8mL，于自动振荡器内振荡30min。高速离心5min，取上清液，至Oasis HLB 固相萃取小柱，再收集流出液于40℃温度下氮气吹干；以1mL 的0.1%(v/v)甲酸水溶液-（90:10,v/v）乙腈溶液溶解，再涡旋振荡，然后过0.22μm 的滤膜。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18（1.7μm，100mm×2.1mm)；流动相：A 相为0.1%(v/v)甲酸水溶液，B 相为乙腈；梯度洗脱程序：0～1.0min，10%B；1.0～5.0min，10%B ～90%B；5.0 ～6.5min，90%B；6.5 ～6.6min，90%B ～10%B；6.6 ～8.0min，10%B；流速0.30mL/min；进样量10μL。

1.2.4 质谱条件

真菌毒素相关参数见表1。

表1 6种真菌毒素的母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量

2 结果

2.1 仪器条件优化

现有文献报道的基于LC-MS/MS 测定真菌毒素大多采用ESI 源正离子模式电离的分析方法[12-22]。本试验具体离子等信息如表1 所示。

2.2 固相萃取小柱的选择

本试验对QuEChERS 和Oasis HLB 两种方法进行了比较。从小麦中选取阴性样品进行添加回收试验，无需活化、洗脱和淋洗等步骤，采用Oasis HLB 固相萃取小柱进行净化后，回收率、基质干扰均优于QuEChERS 净化结果。

2.3 基质效应、标准曲线、检出限和定量限

小麦中6 种真菌毒素的标准曲线、检出限、相关系数、基质效应、定量限见表2。

表2 6种真菌毒素在小麦中的标准曲线、相关系数、检出限、定量限和基质效应

2.4 回收率与精密度

图1 为小麦空白样品中真菌毒素加标MRM 色谱图。

图1 小麦加标样品的MRM色谱图

6 种真菌毒素在小麦中的回收率和相对标准偏差见表3。

表3 6种真菌毒素在小麦中的回收率和相对标准偏差(n=5)

2.5 方法应用

采用优化后的仪器条件和前处理条件分别对随机采集的50 个小麦样品进行分析，在5 个样品中检出了脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷，含量范围为25.2 ～50.3μg/kg。

3 结论

本文采用直通式净化方法开发出一种简单快速的样品前处理方案和UPLC-MS/MS 分析方法，以小麦为例分析了6 种真菌毒素。该方法简单、快速、有效，能满足多种粮谷中真菌毒素的检测需要。