气调贮藏对接种粉红单端孢霉苹果的影响研究

曹嘉玥，李晓慧，李庆秀，王 娜，闫师杰,3,*，陈存坤

（1.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300392；2.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；3.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津 300392；4.天津市农业科学院农产品保鲜与加工技术研究所（国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津）），农业农村部农产品贮藏保鲜重点实验室，天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津 300384）

苹果甘甜性凉，营养丰富，是世界四大水果之冠[1]。因其适应性强、可长期贮藏、便于运输、满足全年供应等特点，深受广大消费者喜爱[2]。由粉红单端孢霉（Trichothcium roseum）引起的心腐病是我国苹果采后贮藏期间的主要病害，国内将该类病害统称为苹果霉心病[3]。近年来苹果的霉心病危害程度有所上升，常因果实心室发霉，果心腐烂和病果早期脱落，果肉腐烂等而损失[4]，且如果贮藏条件不当，其发病率可高达40%[5-7]。

粉红单端孢霉可导致甜瓜、番茄、杏、芒果等果实采后腐烂，在侵染果实过程中可以穿过心皮，导致整个果实腐烂，除了造成严重的经济损失，还会产生单端孢霉烯族类毒素[8-10]，这类毒素具有致癌、致畸、致突变等作用，严重威胁人类健康[11]。目前，主要采用气相色谱法[12]、高效液相色谱法[13-14]、液相色谱串联质谱法[15]等方法检测果蔬中真菌毒素，其中应用最广的方法是液相色谱串联质谱法。

目前我国苹果主要以冷藏（CS）方式贮藏保鲜，气调（CA）贮藏占比在10%以下，而发达国家的苹果气调贮藏占总贮藏量的40%以上[16]。冷藏仅通过控制温度和湿度来延缓果实衰老，而气调贮藏是在冷藏的基础上，进一步控制环境中的二氧化碳和氧气的比例，具有比冷藏更显著的保鲜效果[17]。在苹果、梨、猕猴桃、四季豆等多种果蔬上的研究发现，气调贮藏可以有效抑制果蔬的呼吸强度，维持较高的抗氧化酶活性，从而提高贮藏品质[18]。气调贮藏对接种苹果毒素含量及相关生理指标的影响是通过CO2和O2的协同作用，在气调贮藏中，调节适宜O2与CO2体积分数的联合贮藏效果比O2与CO2单独作用显著。任小林等[19]认为，富士苹果果肉致密并且不耐高CO2，气调贮藏时的CO2体积分数要始终低于O2体积分数。目前，针对调节O2和CO2体积分数对接种粉红单端孢霉苹果在贮藏期间的影响相关研究报道较少。因此，本研究以红富士苹果为材料，采用固相萃取-超高效液相色谱质谱法对不同气调贮藏的接种苹果毒素含量进行检测，并测定苹果的生理指标，探究不同气调贮藏条件对苹果毒素含量及生理指标的影响，旨在为苹果贮藏保鲜技术研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

市售红富士苹果，于2021 年10 月下旬在山东省烟台市采摘，选择大小均匀、成熟度一致、无机械损伤的果实，采后当日运回天津农学院冷库中，单果质量200～250 g。

粉红单端孢霉（Trichothcium roseum），北纳创联生物技术有限公司；毒素标准品（赭曲霉素A（OTA）、T-2 毒素、HT-2 毒素、镰刀菌烯酮（Fus-X）、新茄腐镰刀菌烯醇（NEO）、细交链孢菌酮酸（TeA）、乙二酰镳草镰刀菌烯醇-蛇形毒素（DAS）、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-AcDON）、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-AcDON）），美国Romer 公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、乙醇、乙腈（分析纯、色谱纯）、柠檬酸、乙酸铵（色谱纯），天津韵尼科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

Acquity TM 型超高效液相色谱-Xevo TQ-S 串联质谱仪，美国Waters公司；CA-10型呼吸代谢测定仪，美国Stable systems 公司；GC-14C 型气相色谱仪，日本岛津公司；Check point 型便携式O2/CO2测定仪，丹麦PBI Dansensor 公司；3-30k 型台式高速离心机，德国Sigma 公司；N-EVAP-112 型氮吹仪，美国Organomation 公司；VORTEX-BE1 型涡旋混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；PAL-1 型数显糖度计，日本爱拓公司；PHS-3B型数显酸度计，上海雷磁仪器厂；BSC-250 型恒温恒湿培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 方法

1.2.1 试验流程

菌种培养→制备孢子悬浮液→接种苹果→气调贮藏→指标测定

1.2.2 菌种培养

在超净工作台操作，将粉红单端孢霉标准菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面上，在25 ℃条件下避光培养，采用平板划线法将培养好的菌接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养皿上，将培养皿封口后，在25 ℃恒温恒湿培养箱中避光培养7～8 d，备用。

1.2.3 孢子悬浮液的制备

参照Bi 等[20]的方法并略作修改。用无菌水冲洗带菌培养基，在显微镜下采用血球计数板计数，每个样品重复计数2～3次，计算出每毫升孢子悬浮液所含孢子细胞数（5 个中格孢子细胞总数×5×104×稀释倍数），及孢子悬浮液的浓度，并将孢子悬浮液浓度调节至108个/mL。

1.2.4 接种

随机选取无机械损伤、大小均一的红富士苹果，在超净工作台用75%的乙醇消毒后，再用灭菌打孔器在苹果的赤道部位均匀打4个孔，将孢子悬浮液接入苹果，每孔50 μL，每个处理接种35个苹果。

1.2.5 气调贮藏

本试验以具有良好气密性的盒子作为气调贮藏的场所，并通过充入N2和CO2调节气体组成。将接种有粉红单端孢霉的苹果分别放于不同气体组分条件（气调Ⅰ：3%～4% O2+1%～2% CO2；气调Ⅱ：3%～4%O2+3%～4%CO2；气调Ⅲ：3%～4%O2+5%～6%CO2）进行贮藏，对照组（CK）不进行气调处理，贮藏温度均为15 ℃，相对湿度为90%～95%，每5 d 进行1 次产毒素水平和相关生理指标测定。

1.2.6 测定指标与方法

1.2.6.1 粉红单端孢霉生长曲线的绘制

各处理均取4个苹果作为每次测量的固定用果，用数显游标卡尺测定，采用十字交叉法测定苹果病斑横纵直径，取平均值作为腐烂直径，每5 d 记录1次，当腐烂直径大于60 mm 时结束测定，以贮藏时间为横坐标，腐烂直径为纵坐标，绘制不同气体贮藏条件下粉红单端孢霉生长曲线。

1.2.6.2 苹果中毒素含量

参考韦迪哲等[21]的方法略作修改，对已接种苹果中的毒素进行检测。

1.2.6.3 可溶性固形物含量

参照Tappi 等[22]的方法，随机挑选6 个已接种苹果，用PAL-1数显糖度计测量可溶性固形物含量，将苹果的未发生腐烂部分削皮、切块、用压汁器压汁，并用纱布过滤，设定3组平行测量。

1.2.6.4 可滴定酸含量

随机选取6个已接种苹果，将苹果未腐烂部位切块压汁，纱布过滤后用PHS-3B 数显酸度计进行测量，每个苹果重复3次测量，其结果用百分比表示。

1.2.6.5 呼吸强度

将Liu 等[23]的方法稍加修改后，随机选取6 个苹果作为呼吸强度定果，闷气时间为1 h，闷气温度为苹果贮藏温度，采用CA-10 呼吸代谢测定仪测定样品的呼吸强度，单位为mg CO2/(kg·h)，每个处理设3 组平行。

1.2.6.6 乙烯释放量

随机挑选6 个已接种苹果，采用GC-14C 型气相色谱仪进行乙烯释放量的测定，单位为μL/（kg·h），每个处理设3组平行。

1.2.7 数据处理

采用SPSS 23.0 软件进行显著性分析，用WPS 软件进行数据统计分析，用Origin 2021软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 气调贮藏对苹果中粉红单端孢霉产毒的影响

2.1.1 气调贮藏对粉红单端孢霉生长曲线的影响

由图1可以看出，接种粉红单端孢霉后的苹果在贮藏期间都会出现病斑，且在贮藏期间其病斑（腐烂直径）持续增大，在气调Ⅱ（3%～4%O2+3%～4%CO2）环境下，粉红单端孢霉生长速度较其他两种气调环境快，气调Ⅰ（3%～4% O2+1%～2% CO2）和气调Ⅲ（3%～4% O2+5%～6% CO2）之间无显著性差异。10～25 d期间，接种粉红单端孢霉苹果的对照组腐烂直径显著大于气调组（P＜0.05），说明适当上调二氧化碳体积分数可以延缓粉红单端孢霉的生长。

图1 不同气调处理对苹果粉红单端孢霉生长曲线的影响Fig.1 Effects of different CA treatments on growth curves of T.roseum

2.1.2 气调贮藏对接种苹果中毒素产生情况的影响

由表1可以看出，接种苹果在贮藏期间有TeA毒素产生，其他几种毒素均未达到检测限。贮藏前期（0、5 d）各处理接种苹果中均未检测到TeA毒素，相同贮藏时间内对照组毒素含量显著高于气调组（P＜0.05），说明适当提高贮藏环境中CO2体积分数有利于抑制接种苹果中毒素的积累，但并不是CO2体积分数越高抑制效果越好，贮藏在气调Ⅱ环境中的TeA毒素含量高于气调Ⅰ和气调Ⅲ，气调Ⅰ与气调Ⅲ差异不显著。

表1 贮藏期间接种粉红单端孢霉的苹果中TeA的检出情况Table 1 Contents of TeA toxin of apples inoculated with T.roseum during storage 单位：μg/L

2.2 气调贮藏对苹果产毒相关生理指标的影响

2.2.1 气调贮藏对苹果可溶性固形物含量的影响

由图2可以看出，所有处理苹果中可溶性固形物含量均呈现先上升后下降的变化趋势，各个气调处理组均于贮藏15 d 时达到最高值，气调Ⅰ、气调Ⅱ、气调Ⅲ苹果中可溶性固形物含量峰值分别为13.6%、13.7%、13.7%，而对照组于贮藏20 d 时达到最高值。在贮藏15 d 后气调组可溶性固形物含量又迅速下降，气调Ⅲ处理组苹果中可溶性固形物含量始终低于其他2组气调处理。在贮藏后期，气调处理的苹果可溶性固形物含量均低于对照组，说明气调贮藏可有效抑制苹果的呼吸作用，更有利于延长果品的贮藏期。

图2 不同气调处理对接种苹果中可溶性固形物含量的影响Fig.2 Effects of different CA treatments on soluble solids contents of inoculated apples

2.2.2 气调贮藏对苹果可滴定酸含量的影响

由图3 可以看出，3 种气体组分下贮藏的接种苹果中可滴定酸含量均呈先上升后下降的变化趋势。气调Ⅰ、气调Ⅱ、气调Ⅲ组苹果的可滴定酸含量分别于第10、5、5 天时达到高峰，而后开始下降。在贮藏中后期，气调Ⅰ和气调Ⅱ处理苹果中可滴定酸含量普遍略高于对照组。气调Ⅲ在贮藏25 d时低于对照组，说明气调处理可在贮藏中后期适当抑制接种苹果中可滴定酸的降解，延缓果实成熟和品质劣变。

图3 不同气调处理对接种苹果中可滴定酸含量的影响Fig.3 Effects of different CA treatments on titration acid contents of inoculated apples

2.2.3 气调贮藏对苹果呼吸强度的影响

由图4 可以看出，在贮藏前期，随着贮藏时间的延长，气调和对照处理接种苹果的呼吸强度均呈上升趋势，气调Ⅰ、气调Ⅱ、气调Ⅲ以及对照组分别于第10、15、15、10天达到呼吸高峰，且对照组的呼吸高峰值显著高于气调组（P＜0.05）。说明贮藏环境中适宜的高二氧化碳体积分数有助于推迟接种苹果呼吸高峰的出现时间，并能大幅度降低其呼吸强度。

图4 不同气调处理对接种苹果呼吸强度的影响Fig.4 Effects of different CA treatments on respiration rates of inoculated apples

2.2.4 气调贮藏对苹果乙烯释放量的影响

由图5 可以看出，在3 种气调环境下，接种粉红单端孢霉的苹果乙烯释放量快速增加，气调Ⅰ和对照组的苹果在第15 天出现乙烯释放高峰，气调Ⅱ和气调Ⅲ处理的苹果于第20 天出现乙烯释放高峰，之后下降，说明气调处理有助于降低果实乙烯释放峰值，且高体积分数的二氧化碳能够推迟乙烯释放高峰的出现时间。

图5 不同气调处理对接种苹果乙烯释放量的影响Fig.5 Effects of different CA treatments on ethylene release of inoculated apples

3 讨论与结论

粉红单端孢霉侵染水果后会产生如T-2 毒素、HT-2毒素等单端孢烯族毒素，它们和伏马毒素、雪腐镰刀菌烯醇等共同隶属于镰刀菌毒素，这些镰刀菌毒素能在植物中代谢或结合并转化为其他霉菌毒素[24]。细交链孢菌酮酸是由链格孢菌或其他植物病原菌产生的一种真菌毒素[25]。本试验中所产生的TeA 毒素可能是由于粉红单端孢霉所产生的镰刀菌毒素转化而来，但具体产生途径还需进一步探究。

接种苹果在贮藏期间对照组TeA 含量远高于气调组，说明适当提高贮藏环境中CO2体积分数有利于抑制接种苹果中毒素的积累，但并不是CO2体积分数越高抑制效果越好，贮藏在气调Ⅱ环境下苹果的TeA毒素含量高于气调Ⅰ和气调Ⅲ，气调Ⅰ与气调Ⅲ差异不显著。有研究表明，苹果心腐病在贮藏期发病情况与贮藏温度以及贮藏环境中O2、CO2等有关，且与贮藏温度呈正相关[26]；Ali 等[27]将荔枝果实贮藏于10 种不同的气体环境下，贮藏温度为（5±1）℃，研究不同气体组分对果皮褐变、生化特性和抗氧化活性的影响，结果表明，1%O2+5%CO2气调处理可延缓果皮褐变，保持抗氧化活性和生化特性，更好地保持荔枝果实的感官品质。然而，不是所有气调保鲜都可以延长水果货架期，当气调参数设置不当时，会对果蔬起反作用。钱卉苹等[28]研究表明，CO2体积分数过高会造成李子和鸭梨褐变以及风味物质代谢紊乱，还可使桃口感变差。

本试验结果表明：气调贮藏有明显延缓粉红单端孢霉生长的作用，并能降低苹果中TeA 毒素含量，气调Ⅰ（3%～4% O2+1%～2% CO2）和气调Ⅲ（3%～4%O2+5%～6%CO2）对粉红单端孢霉生长以及毒素积累的抑制效果优于气调Ⅱ（3%～4% O2+3%～4% CO2）。贮藏25 d 时，与其他2 种气体环境相比，气调Ⅲ中的苹果可溶性固形物含量最低，气调Ⅰ和气调Ⅲ环境下的苹果中可滴定酸含量低于气调Ⅱ，适当提高贮藏环境中CO2体积分数有利于抑制接种苹果中TeA毒素的积累以及推迟呼吸高峰和乙烯释放高峰的出现，进而可以提高果实的贮藏品质，延长果实的采后寿命，但并不是CO2体积分数越高抑制效果越好。