基于网络药理学和临床研究探索补肺活血胶囊对气虚血瘀型尘肺患者的影响

杭文璐，李婉君，邵 青，尹楠楠，周贤梅，赵 杰

（1.徐州医科大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，徐州 江苏 221000； 2.南京中医药大学第一临床医学院，南京 江苏 210000； 3.徐州医科大学第一临床学院，徐州 江苏 221000； 4.徐州医科大学第二附属医院尘肺科，徐州 江苏 221000； 5.徐州医科大学第二附属医院药剂科，徐州 江苏 221000）

尘肺是全球主要的职业健康危害，以肺部炎症和弥漫性纤维化为主要病理表现。研究表明，30 年内尘肺的发病率增加了66%［1］，重症患者的发病率也持续上升，预后差，治疗手段极其有限［2］。鉴于尘肺患者在脱离粉尘环境后病情仍会进展，现有治疗措施均未能显著改善临床结局，探索尘肺发病和病情进展的关键靶点及药物疗效评价是重要的研究方向。通过利用现代科学技术，以药物和疾病的交互靶点为核心，在临床应用为导向的关联整合分析下，获得有价值的作用靶点和机制，促进药物及疾病的精准结合和合理应用［3］。

已有研究证实补肺活血胶囊可以改善尘肺患者的临床症状［4］。该药以黄芪、赤芍、补骨脂组方，提取补骨脂素、没食子酸、黄芪甲苷Ⅳ等多种有效成分［5］，以益气活血、补肺固肾为治则。本研究通过网络药理学技术探索补肺活血胶囊治疗尘肺的药效机制，并进一步根据富集分析结果验证药物的临床疗效，以期为中成药制剂的临床应用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 网络药理学

1.1.1 获取补肺活血胶囊药物成分靶点 通过TCMSP（http： / /tcmspw.com/） 检索“黄芪” “赤芍”，基于口服生物利用度（OB） 和类药性（DL） 参数，筛选出OB≥30%和DL≥0.18 的药物成分及其对应的靶点。通过文献检索筛查补骨脂的化学成分及药动学参数。通过ETCM（http： / /www.tcmip.cn/ETCM/） 数据库检索 “黄芪”“赤芍” “补骨脂”，把药物靶点名录入Uniprot 数据库（ https： / /www.uniprot.org/） 中，通 过 Retrieve/ID mapping，检索对象设定为“homosapiens”，获得去重后靶点的标准基因名。

1.1.2 构建药物-疾病靶点关系网络 通过GeneCards（ https： / /www.genecards.org/） 检 索 关 键 词“pneumoconiosis”，通过UniProt 数据库转换标准基因名并去重后，与补肺活血胶囊的标准基因名通过韦恩图匹配，获得药物-疾病交互基因，导入STRING 数据库（https： / /string-db.org/，Version： 11.5），对象设定为 “homo sapiens”，构建蛋白质互作网络，将TSV 格式文件导入Cytoscape 3.9.1 进行网络拓扑学分析，获得度值（degree）在平均值以上的靶点信息。

1.1.3 富集分析 在微生信平台 （ http： / /www.bioinformatics.com.cn/） 对核心靶点进行GO 和KEGG 富集分析，获得生物学过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）、KEGG 通路富集分析及相关通路的靶点映射。

1.2 临床研究

1.2.1 一般资料 采用徐州矿务集团总医院药剂科的“智能规则引擎处方前置审核系统” 筛选2019 年至2022 年于尘肺科、呼吸与危重症医学科应用补肺活血胶囊超过12 个月的气虚血瘀型尘肺患者及常规治疗的尘肺患者。符合气虚血瘀型尘肺者156 例，其中治疗组101 例患者，对照组55 例患者。通过病历查看、电话随访、面访等方式采集患者的资料信息，其中5 例患者未提供吸烟信息，组间差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，两组的一般资料见表1。研究经医院伦理委员会批准（ ［2018］ 120501）。

表1 两组患者一般资料比较（n＝156）

1.2.2 诊断标准

1.2.2.1 西医诊断标准 依照GBZ 70-2015 《职业性尘肺病的诊断》 中尘肺患者诊断原则及分期标准［6］。

1.2.2.2 中医诊断与辩证标准 按照国家中医药管理局医政司颁布的中医诊疗方案肺萎病气虚血瘀证［7］，设定诊断标准。主症为咳嗽、痰少，胸闷气短，动则加重，心慌乏力； 次症为口唇爪甲紫暗，肌肤甲错，杵状指； 舌脉为舌质暗或有瘀点、瘀斑，脉沉细或涩。满足主症中2 项及次症中1 项或主症中1 项及次症中2 项内容者，结合舌脉则可诊断。

1.2.3 纳入标准 ①具有明确的粉尘接触史，并符合中西医诊断的Ⅰ期至Ⅲ期尘肺患者； ②脱离粉尘时间超过6 个月； ③累计应用补肺活血胶囊12 个月及以上。

1.2.4 排除标准 ①妊娠期或哺乳期妇女，精神病患者；②与尘肺并发症无关的严重、未控制器质性病变或感染，如失代偿的心、肺、肾功能衰竭等； ③长期使用糖皮质激素或者免疫抑制剂等导致的免疫功能减退者。

1.2.5 治疗手段 采用回顾性队列研究方法。根据尘肺气虚血瘀证的诊断标准及纳入、排除标准，将患者分为西医对照组和补肺活血胶囊联合治疗组。对照组治疗遵循现有临床指南和诊疗方案，治疗包括①按需氧气吸入； ②化痰、抗氧化药物； ③解痉平喘药物； ④如患者在病程中出现病情急性加重，合并下呼吸道感染、肺部感染等情况，根据病情给予抗感染治疗； ⑤高血压、2 型糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、前列腺增生等稳定期基础疾病按需治疗。治疗组在对照组的基础上，联合应用补肺活血胶囊（广东雷允上药业有限公司，0.35 g/粒，每次4 粒，每天3次） 累计超过12 个月。

1.2.6 补肺活血胶囊治疗的中医证候积分和疗效比较 将主症（咳嗽次数、咳嗽程度） 和次症（憋喘、咳痰、气短） 赋分，在入院基线期、治疗后6 月、治疗后12 月时根据中医证候积分量表（表2） 对患者进行中医症候评价。根据治疗前后患者的中医症状差值与治疗前的评分比进行疗效评价。治疗后中医症状评分减少≥95% 为临床控制，评分减少≥70%且＜95%为显效，评分减少≥30%且＜70%为有效，评分减少＜30%为无效。

表2 中医证候积分量表

1.2.7 补肺活血胶囊对尘肺核心靶基因的影响 采集尘肺患者清晨空腹静脉血5 mL，采用细胞因子联合检测试剂盒（免疫荧光法，杭州赛基生物科技有限公司），以流式微球阵列术检测TNF-α、IL-1β、IL-6 水平。

1.2.8 补肺活血胶囊对HBP 水平的影响 采集尘肺患者清晨空腹静脉血5 mL，采用肝素结合蛋白（HBP） 测定试剂盒（中翰盛泰生物技术股份有限公司） 以免疫荧光干式定量法检测HBP 水平。

1.2.9 安全性指标检测 通过对比治疗前后血常规、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、直胆红素、肌酐、尿素、凝血功能等指标，评价药物治疗安全性。

1.2.10 统计学分析 通过SPSS 26.0 软件进行处理，符合正态分布的计量资料以（±s） 表示，组间比较采用独立样本t检验，组内治疗前后比较采用配对样本t检验； 不符合正态分布的资料以中位数（四分位数） 表示，组间比较采用Mann-Whitney U 检验，组内治疗前后比较采用Wilcoxon符号秩检验； 分类计数资料以百分比表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学研究

2.1.1 补肺活血胶囊和尘肺病的靶点信息 通过TCMSP以OB≥30%且DL≥0.18 为阈值筛选出药物潜在活性成分，得到黄芪20 个，赤芍29 个，文献检索补骨脂活性成分4个，具有靶点的活性化合物信息见表3。筛选得到黄芪相关靶点462 个，赤芍157 个，补骨脂39 个，汇总去重后余229 个。通过ETCM 数据库，筛选出候选靶基因共598 个，其中黄芪272 个，赤芍105 个，补骨脂221 个，汇总删除重复项后余324 个。合并靶基因后通过UniProt 数据库将487个候选靶点转为标准基因名。在Genecards 中收集到238 个疾病基因，疾病相关性排名前三位的蛋白质编码为TNF、IL1β、IL6，将补肺活血胶囊潜在的作用靶点通过韦恩图映射到尘肺病相关靶点中，得到共同靶点40 个，见图1。

图1 补肺活血胶囊活性成分靶点与尘肺病靶点韦恩图

表3 补肺活血胶囊的活性化合物信息

2.1.2 补肺活血胶囊治疗尘肺病的PPI 网络构建 将靶点输入STRING 数据库的multiple proteins 检索条目，构建靶点蛋白互作（PPI） 网络，见图2。网络中共包含40 个节点，414 条边。把输出结果tsv 文件导入Cytoscape 软件，通过网络拓扑学对作用靶点进行分析，degree 均值41.4，大于均值的靶点共24 个，均值排名前三的核心靶点为TNFα、IL-1β、IL-6。

图2 PPI 网络图

2.1.3 GO 和KEGG 富集分析 GO 富集分析根据补肺活血胶囊的BP、CC、MF 的前十位条目排序，见图3A。生物过程涉及对生物刺激的细胞应答、对细胞因子的正向调节等（图3B）； 细胞组分主要涉及细胞膜上的膜筏、膜微结构域、分泌颗粒腔等（图3C）； 分子功能靶点涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性、信号受体激活剂活性、肿瘤坏死因子受体超家族结合等（图3D）。KEGG 分析显示，补肺活血胶囊治疗尘肺病的关联通路包括IL-17 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等，其在细胞因子-细胞因子受体相互作用中的靶点映射见图4。

图3 GO 富集分析

图4 靶点在细胞因子-细胞因子受体相互作用中的映射图

2.2 临床研究

2.2.1 中医证候积分和疗效比较 两组患者治疗前后中医证候积分经双因素重复测量方差分析结果显示，不同时点、时点与分组的交互效应均具有统计学意义（P＜0.05），而不同分组之间的比较无统计学意义（P＞0.05）。治疗前、治疗后6 个月、治疗后12 个月，治疗组和对照组之间的中医证候积分比较无统计学差异（P＞0.05）； 治疗后6 个月，治疗组和对照组中医证候积分低于治疗前（P＜0.05）； 治疗后12 个月，治疗组和对照组中医证候积分低于治疗前（P＜0.05），也低于治疗后6 个月（P＜0.05），治疗组中医证候积分低于对照组（P＜0.05），见表4。治疗组总有效率高于对照组（P＜0.05），见表5。

表4 两组中医证候积分比较（分，±s）

表4 两组中医证候积分比较（分，±s）

注： 与同组治疗前比较，*P＜0.05； 与同组治疗后6 个月比较，＃P＜0.05； 与同时间点对照组比较，△P＜0.05。

组别例数/例治疗前治疗后6 个月治疗后12 个月治疗组10111.44±3.8810.27±2.86*9.26±2.40*＃△对照组5511.65±3.9111.24±3.23*10.84±3.32*＃

表5 两组中医证候疗效比较［例（%）］

2.2.2 补肺活血胶囊对核心靶点TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的影响 两组治疗前TNF-α、IL-1β、IL-6 水平差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗组和对照组治疗后TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于治疗前（P＜0.05），两组间的治疗效果无显著差异（P＞0.05），见表6。

表6 两组TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比较（pg/mL，±s）

注： 与同组治疗前比较，*P＜0.05。

组别例数/例TNF-α IL-1β IL-6治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后治疗组1012.23（1.17，4.41） 1.65（0.94，2.90）* 2.21（1.11，4.19） 1.56（1.04，2.16）* 5.47（3.06，10.11） 3.20（2.27，4.65）*对照组551.96（1.23，3.84） 1.40（0.94，2.33）* 2.10（1.13，4.22） 1.58（1.12，3.94） 4.47（3.10，7.83） 2.27（2.18，4.31）*

2.2.3 补肺活血胶囊对HBP 水平的影响 156 例患者的回顾性研究中，具有有效HBP 结果的共128 例，其中治疗组97 例，对照组31 例。治疗前两组HBP 水平无显著差异（P＞0.05）。治疗后，治疗组HBP 水平低于治疗前（P＜0.05），也低于对照组（P＜0.05）。对照组治疗前后HBP水平无显著差异（P＞0.05），见表7。

表7 两组HBP 水平比较［M （P25，P75）］

2.2.4 安全性评价 观察两组治疗后的血常规、肝功能、肾功能和血凝变化，记录超出正常值范围的数量，并计算发生率，见表8。由此可知，治疗期间对照组和治疗组均未发生严重不良反应，治疗组乳酸脱氢酶活性升高比例高于对照组。

表8 两组安全性评价汇总表

3 讨论

金石长期从口鼻吸入，损伤肺气的宣发肃降，逐渐形成“正虚” “血瘀” 等病理状态，因此，气虚血瘀是尘肺病机的关键。补肺活血胶囊中黄芪补气固表、健脾和中；赤芍清热凉血、散瘀止痛； 补骨脂纳气平喘、补肾壮阳，体现中医药“益气活血，补肺固肾” 的重要治则。已有多项研究证实了以上药物成分在尘肺相关疾病中的疗效，如黄芪甲苷可抑制成纤维细胞胶原的表达和向肌成纤维细胞的转化［8］，可增强机体对缺氧和应激的抵抗力病发挥抗炎作用［9］； 赤芍能够降低IL-6 和TNF-α 水平，通过抗氧化、抑制血栓素生成和扩张肺血管有效改善微循环［10］； 补骨脂素可抑制肌成纤维细胞活化、胶原沉积减轻肺纤维化［11］。而通过对尘肺致病靶点的深入探索，联合中药复方制剂发挥多靶点、多通路的协同作用，可能是尘肺病治疗的新方向。

本研究通过网络药理学分析发现，补肺活血胶囊治疗尘肺病在细胞因子的调节及细胞因子受体相互作用中发挥关键作用。临床研究对尘肺患者进行治疗前后中医证候积分和疗效比较，结果表明，患者在常规西药治疗的情况下，经12 个月补肺活血胶囊联合治疗，能够显著改善患者的咳嗽、喘息、咳痰、气短等症状，但低于6 个月治疗周期的效果并不显著。因此，在中医辨证论治的基础上，长疗程补肺活血胶囊治疗协同西药对气虚血瘀型尘肺患者具有良好的治疗效果，可有效改善患者的临床症状。网络药理学结果表明，补肺活血胶囊治疗尘肺的核心靶点为TNF、IL-1β、IL-6 等促炎、促肺纤维化细胞因子。TNF-α 具有多种生物活性，高表达的TNF-α 可刺激成纤维细胞产生胶原蛋白，导致纤维化和矽尘结节形成［12］。IL-1β 可增强炎症微环境包围沉积的粉尘晶体，驱动肺部炎症和相关病理［13］。粉尘暴露可作用于肺泡巨噬细胞，被模式识别受体识别激活含NLR 家族Pyrin 域蛋白3 （NLRP3），引起IL-1β 的释放［14］，增加肺力学参数，诱导弥漫性肺实质炎症，增加中性粒细胞浸润及胶原沉积［15］。IL-6 免疫过程和炎症趋化方面发挥重要作用，其过度表达可以降低肺弹性，导致细胞外基质和肌成纤维细胞积聚［16］，并与尘肺患者的生命状态相关［17］。本研究选用TNF-α、IL-1β、IL-6 作为评价尘肺治疗效果的主要疗效指标，结果表明，尘肺患者联合补肺活血胶囊口服可降低TNF-α、IL-1β、IL-6 水平，其中IL-1β的下降程度优于常规治疗，或可延缓长期粉尘吸入引起的肺部炎症及肺纤维化进展。

HBP 是一种多功能蛋白，可诱导血管渗漏，增加通透性，引起水肿，并具有促炎作用［18］，此外，还可增加M1巨噬细胞的浸润和促进炎症因子（如TNF-α、IL-6、IL-1β）的分泌［19］。本研究采用HBP 作为次要疗效指标，结果表明，补肺活血胶囊可降低HBP 水平，可能在调节尘肺引起的感染、炎症反应及疾病进展方面具有一定价值。

补肺活血胶囊的安全性评价表明，用药后个别患者可出现血常规、肝功能、肾功能、血凝异常，乳酸脱氢酶升高例数高于对照组，其余指标变化考虑与疾病正常进展及基础疾病、高龄等因素相关。有研究发现，乳酸脱氢酶有助于了解尘肺的疾病进展［20］，总乳酸脱氢酶活性和乳酸脱氢酶比率（血浆/细胞） 是SiO2粉尘暴露诱导毒性的标志物［21］。因此，在用药过程中，需监测患者乳酸脱氢酶的变化情况，评估药物疗效及安全性。

综上所述，补肺活血胶囊可通过多靶点多通路干预尘肺病，缓解机体的炎症反应。本研究阐述了补肺活血胶囊治疗尘肺病的关键成分及作用靶点，并通过临床应用验证了网络药理学的预测结果，为中医药治疗尘肺病提供了一定思路和方向。