桂枝茯苓丸对慢性阻塞性肺疾病小鼠气道重塑的影响

张 真，杨亿然，刘 雨，谭宇军，吴 哲，谭光波，胡学军，邓秀娟*

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208； 2.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006）

慢性阻塞性肺疾病 （chronic obstructive pulmonary disease，COPD） 是一种以不可逆的气流受限为特征的常见肺系疾病，气道重塑是COPD 发生发展过程中重要的病理特征，源自于气道组织的反复损伤-修复过程，是导致患者气流受限和激素抵抗的主要原因［1-3］。上皮间质转化 （epithelialmesenchymal transition，EMT） 是指上皮细胞失去极性并转化为可移动的间充质细胞，其形态学改变包括上皮细胞连接和极性复合物的破坏，以及细胞骨架结构的重组［4］。目前，EMT 已被认为是许多呼吸系统疾病的基础，与气道纤维化、气道重塑和随后的气流阻塞有关［5］。大量研究表明，核因子活化B 细胞的κ 轻链增强子（nuclear factor kappalight-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB） 所介导的蜗牛同源蛋白（Snail） 是EMT、细胞粘附和增殖的关键调节因子，NF-κB/Snail 通路在EMT中具有重要作用［6-8］，与COPD 气道重塑密切相关。中医学认为，COPD 气道重塑是在外来六淫之毒的持续作用下，肺络受损，内生痰瘀之毒，痹阻肺络而成，“毒损肺络” 是其关键病机［9-12］。桂枝茯苓丸出自《金匮要略》，是治疗癥瘕积聚的经典名方，具有活血化痰、消癥通络的功效。因此，本研究以“毒损肺络” 为理论基础，探讨桂枝茯苓丸对NF-κB/Snail 介导的EMT 的影响，进而揭示其改善COPD 气道重塑的内在机制。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雄性C57BL/6 小鼠40 只，体质量18～22 g，由湖南中医药大学动物实验中心提供［实验动物生产许可证号SCXK （湘） 2019-0004，动物质量合格证号43072721100875058］，饲养于湖南中医药大学动物实验中心［实验动物使用许可证号SYXK （湘） 2019-0009］，温度22 ～24 ℃，相对湿度50% ～60%，昼夜12 h/12 h 交替照明，自由进食和饮水。本实验经湖南中医药大学动物实验伦理委员会批准 （伦理号 LLBH-202203140006）。

1.2 药物与试剂 金圣牌香烟，由江西中烟工业有限责任公司生产，焦油含量8 mg，烟气烟碱含量0.8 mg，CO 含量9 mg。桂枝茯苓丸（国药准字Z20027562） 购自成都九芝堂金鼎药业有限公司，按每100 丸（15 g） 加450 mL 蒸馏水的比例溶解（即每30 mL 药液含1 g 药物），现用现配。NF-κB抑制剂EVP4593 （货号A4217，美国APExBIO 公司）； 4%多聚甲醛固定液（货号BL539A，北京兰捷柯科技有限公司）； 白细胞介素-8 （interleukin-8，IL-8） ELISA 试剂盒（货号MU30010，武汉贝茵莱生物科技有限公司）； 白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6） ELISA 试剂盒、肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） ELISA 试剂盒、兔单抗E-钙粘蛋白、兔单抗Snail、兔单抗IκBα、小鼠单抗NF-κB、小鼠单抗β-actin （货号KE10007、KE10002、E-cadherin、20874-1-AP、13099-1-AP、10268-1-AP、66535-1-Ig、66009-1-Ig，武汉三鹰生物技术有限公司）； 兔单抗α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、兔单抗p-IκBα、兔单抗p-NF-κB ［货号ab124964、ab133462、ab76302，艾博抗（上海） 贸易有限公司］； 苏木素伊红染液、HRP 标记羊抗小鼠二抗、HPR 标记羊抗兔二抗 （ 货号 AWI0020b、AWS0001、AWS0002，长沙艾碧维生物科技有限公司）。

1.3 仪器 自制亚克力透明烟熏箱1.6 m×0.5 m×0.25 m （包含顶部和侧面2 个直径8 cm 的进出气孔），由上海易雕实业有限公司定制； LH-75 型管道风机（深圳市世化电器照明有限公司）； PFTMR 型小动物肺功能检测仪（上海塔望智能科技有限公司）； TS-1 型摇床、GL-88B 型旋涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）； H1650R 型台式冷冻离心机（湖南湘仪科教仪器有限公司）；JB-13 型磁力搅拌器、PHS-3C 型精密PH 计（上海精密科学仪器有限公司）； PW-812 型全自动酶标洗板机、MB-530 型多功能酶标分析仪（深圳市汇松科技发展有限公司）； DYY-60 型电泳仪、DYCZ-24DN 型电泳槽、DYCZ-40D 型转膜仪（北京六一生物科技有限公司）； BioPrep-24 型生物样品均质仪（杭州奥盛仪器有限公司）； ChemiScope6100 型化学发光成像系统 （上海勤翔科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 分组与造模 小鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、桂枝茯苓丸组、EVP4593 组、桂枝茯苓丸+EVP4593 组，每组8 只，模型组和给药组采用被动吸烟的方式造模，每天熏烟2 次，每次使用20 支香烟，持续60 min，中途间隔4 h，每熏烟6 d，休息1 d，总计60 d。

2.2 给药 小鼠给药剂量参考人和动物体表面积折算的等效剂量比率表［13］，得到桂枝茯苓丸组灌胃剂量为273 mg/kg，EVP4593 组皮下注射剂量为1 mg/kg［14］。各组在第61 天（即造模结束后第1天） 开始灌胃或（和） 皮下注射给药，每天1 次，连续14 d，其中桂枝茯苓丸+EVP4593 组在皮下注射EVP4593 后立即灌胃桂枝茯苓丸药液，空白组和模型组灌胃给予等量生理盐水。灌胃过程中，模型组死亡2 只，桂枝茯苓丸组死亡1 只，桂枝茯苓丸+EVP4593 组死亡1 只。

2.3 肺功能指标检测 小鼠腹腔注射1% 戊巴比妥钠（40 mg/kg） 麻醉后，分离暴露气管，进行气管插管固定，使用小动物肺功能检测仪测定每分钟通气量（minute ventilation volume，MV）、吸气峰流量（peak inspiratory flow，PIF） 及呼气峰流量（peak expiratory flow，PEF）。肺功能测定过程中，空白组失败2 只，模型组失败1 只，EVP4593 组失败2 只，桂枝茯苓丸+EVP4593 组失败1 只。

2.4 肺组织病理检查 取小鼠左肺组织于4% 多聚甲醛中固定24 h，脱水后石蜡包埋切片。HE 染色观察肺组织病理形态，肺部炎症的严重程度通过炎症评分进行半定量分析［15］，定义为0 分，无炎症； 1 分，轻度炎症，偶见炎性细胞灶； 2 分，中度炎症，大部分肺泡、支气管或血管壁有1 ～5 层炎性细胞； 3 分，重度炎症，大部分肺泡、支气管或血管壁有5 层以上炎性细胞。每张切片取5 个视野的炎症评分均值作为最终结果。按照文献［16］报道方法，选取最小内径/最大内径＞0.5，且基底膜周径＜2 000 μm 的支气管作为检测对象，通过Image J （v1.53） 软件测定气道管壁总面积（wall area of bronchial tube，WAt） 和支气管基底膜周径（perimeter of basement membrane，Pbm），以Pbm为基值标准化，以WAt 与Pbm 比值代表气道管壁厚度，每张切片选取5 个支气管进行测量。

Masson 染色观察气道纤维化改变，其中胶原纤维呈蓝色。通过Image J （v1.53） 软件测定蓝染面积，以Pbm 为基值标准化，测得蓝染区平均厚度（μm2/μm），每张切片选取5 个支气管进行测量。

2.5 ELISA 法检测肺组织IL-6、IL-8 和TNF-α 水平 称取100 mg 肺组织，剪碎后放入组织研磨器（匀浆管） 中，加入1 mL 1× PBS 溶液，制成匀浆，置于-20 ℃过夜，经反复冻融2 次破坏细胞膜，2～8 ℃、5 000×g 离心5 min，取上清液备用。严格按ELISA 试剂盒说明书操作，检测IL-6、IL-8和TNF-α 水平。

2.6 Western blot 法检测肺组织EMT 和NF-κB/Snail 通路相关蛋白表达 称取25 mg 肺组织，加入300 μL RIPA 裂解液，在生物样品均质仪中研磨为组织匀浆，冰上裂解10 min，12 000 r/min 离心15 min，提取上清液，BCA 试剂盒检测蛋白浓度。配制SDS-PAGE 凝胶，经电泳、转膜、封闭，加稀释后的一抗E-cadherin （1 ∶5 000）、α-SMA （1 ∶1 000）、Snail （1 ∶500）、IκBα （1 ∶1 000）、p-IκBα （1 ∶10 000）、NF-κB （1 ∶1 000）、p-NF-κB（1 ∶1 000）、β-actin （1 ∶5 000），4 ℃孵育过夜，次日室温放置30 min，1×PBST 洗膜3 次，每次15 min，加稀释后的二抗（1 ∶5 000） 室温孵育90 min，1×PBST 洗膜3 次，每次10 min，ECL 化学发光显影，凝胶成像系统成像，通过Image J（v1.53） 软件测定各条带光密度值，以β-actin 为内参。

2.7 统计学分析 通过SPSS 26.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，若不符合正态分布或（和） 方差不齐时，采用非参数检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 桂枝茯苓丸对COPD 小鼠肺功能的影响 与空白组比较，模型组小鼠MV、PIF 和PEF 值降低（P＜0.05）； 与模型组比较，各给药组小鼠MV、PIF 和PEF 值升高（P＜0.05），其中以桂枝茯苓丸+EVP4593 组最为显著（P＜0.05），而桂枝茯苓丸组和EVP4593 组间比较无明显差异（P＞0.05），见表1。

表1 各组小鼠肺功能比较（±s）Tab.1 Comparison of mouse lung function levels in each group （±s）

注： 与空白组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与桂枝茯苓丸组比较，△P＜0.05； 与EVP4593 组比较，▲P＜0.05。

组别动物数/只MV/mLPEF/（mL·s-1）PIF/（mL·s-1）空白组648.62±3.214.95±0.343.77±0.29模型组519.32±5.12*2.09±0.39*2.06±0.24*桂枝茯苓丸组730.62±4.07＃3.51±0.42＃2.54±0.22＃EVP4593 组632.41±2.83＃3.54±0.21＃2.62±0.27＃桂枝茯苓丸+EVP4593 组640.25±3.67＃△▲4.09±0.15＃△▲3.24±0.17＃△▲

3.2 桂枝茯苓丸对COPD 小鼠肺组织病理形态的影响 空白组小鼠肺泡腔完整，黏膜上皮细胞无脱离坏死，黏膜下腺体无增生，气道周围少见炎性细胞，气管腔内无分泌物，基底膜和平滑肌无增生；与空白组比较，模型组小鼠肺泡间隔增厚，支气管的基底膜和平滑肌增生，支气管壁增厚，有大量炎性细胞浸润，气管腔内可见上皮细胞脱离或分泌物，并存在不同程度的狭窄，肺组织炎症评分和气道管壁厚度均增加（P＜0.05）； 与模型组比较，各给药组小鼠上述病理改变减轻，肺组织炎症评分和气道管壁厚度均降低（P＜0.05），其中以桂枝茯苓丸+EVP4593 组最为显著（P＜0.05），而桂枝茯苓丸组和EVP4593 组间比较无明显差异（P＞0.05），见图1、表2。

表2 各组小鼠肺组织炎症评分和气道管壁厚度比较（±s）Tab.2 Comparison of mouse lung inflammation score and airway wall thickness in each group （±s）

表2 各组小鼠肺组织炎症评分和气道管壁厚度比较（±s）Tab.2 Comparison of mouse lung inflammation score and airway wall thickness in each group （±s）

注： 与空白组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与桂枝茯苓丸组比较，△P＜0.05； 与EVP4593 组比较，▲P＜0.05。

组别动物数/只炎症评分/分气道管壁厚度/（WAt·Pbm-1）空白组80.00±0.0016.25±1.31模型组63.00±0.76*41.51±2.35*桂枝茯苓丸组72.00±0.76＃34.43±1.95＃EVP4593 组81.75±0.71＃33.51±1.68＃桂枝茯苓丸+EVP4593 组71.00±0.76＃△▲24.59±1.70＃△

3.3 桂枝茯苓丸对COPD 小鼠肺组织胶原纤维的影响 与空白组比较，模型组小鼠气道蓝染区厚度增加（P＜0.05），胶原纤维增多； 与模型组比较，各给药组小鼠气道蓝染区厚度减小（P＜0.05），胶原纤维减少，其中以桂枝茯苓丸+EVP4593 组最为显著（P＜0.05），而桂枝茯苓丸组和EVP4593 组间比较无明显差异（P＞0.05），见图2、表3。

图2 各组小鼠肺组织Masson 染色（×200）Fig.2 Masson staining of mouse lung tissue for each group （×100）

表3 各组小鼠气道蓝染区厚度比较（±s）Tab.3 Comparison of the thickness of mouse airway blue staining area in each group （±s）

表3 各组小鼠气道蓝染区厚度比较（±s）Tab.3 Comparison of the thickness of mouse airway blue staining area in each group （±s）

注： 与空白组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与桂枝茯苓丸组比较，△P＜0.05； 与EVP4593 组比较，▲P＜0.05。

组别动物数/只气道蓝染区厚度/（μm2·μm-1）空白组87.25±1.01模型组631.51±2.35*桂枝茯苓丸组718.23±1.95＃EVP4593 组817.91±1.68＃桂枝茯苓丸+EVP4593 组711.59±1.70＃△▲

3.4 桂枝茯苓丸对COPD 小鼠肺组织IL-6、IL-8 和TNF-α 水平的影响 与空白组比较，模型组小鼠肺组的IL-6、IL-8 和TNF-α 水平升高（P＜0.05）； 与模型组比较，各给药组小鼠肺组织IL-6、IL-8 和TNF-α 水平降低（P＜0.05），其中以桂枝茯苓丸+EVP4593 组最为显著（P＜0.05），见表4。

表4 各组小鼠肺组织IL-6、IL-8 和TNF-α 水平比较（pg/mL，±s）Tab.4 Comparison of IL-6，IL-8 and TNF-α levels in mouse lung tissue of each group （pg/mL，±s）

表4 各组小鼠肺组织IL-6、IL-8 和TNF-α 水平比较（pg/mL，±s）Tab.4 Comparison of IL-6，IL-8 and TNF-α levels in mouse lung tissue of each group （pg/mL，±s）

注： 与空白组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与桂枝茯苓丸组比较，△P＜0.05； 与EVP4593 组比较，▲P＜0.05。

组别动物数/只IL-6IL-8TNF-α空白组828.74±2.9042.26±3.2431.46±4.19模型组686.77±7.31*88.72±5.19*72.44±6.82*桂枝茯苓丸组760.61±6.95＃65.64±3.61＃46.21±4.07＃EVP4593 组872.11±6.13＃△77.13±4.59＃△62.25±5.38＃△桂枝茯苓丸+EVP4593 组750.07±4.74＃△▲54.82±5.70＃△▲41.72±4.27＃△▲

3.5 桂枝茯苓丸对COPD 小鼠肺组织EMT 相关蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组小鼠肺组织E-cadherin 蛋白表达降低（P＜0.05），α-SMA 蛋白表达升高（P＜0.05）； 与模型组比较，各给药组小鼠肺组织E-cadherin 蛋白表达升高（P＜0.05），α-SMA 蛋白表达降低（P＜0.05），其中以桂枝茯苓丸+EVP4593 组最为显著 （P＜0.05），见图3、表5。

图3 各组小鼠肺组织EMT 相关蛋白条带图Fig.3 Bands of EMT related proteins in mouse lung tissues of each group

表5 各组小鼠肺组织EMT 相关蛋白表达比较（±s）Tab.5 Comparison of EMT-related proteins expressions in mouse lung tissue of each group （±s）

表5 各组小鼠肺组织EMT 相关蛋白表达比较（±s）Tab.5 Comparison of EMT-related proteins expressions in mouse lung tissue of each group （±s）

注： 与空白组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与桂枝茯苓丸组比较，△P＜0.05； 与EVP4593 组比较，▲P＜0.05。

组别动物数/只 E-cadherinα-SMA空白组80.53±0.120.07±0.01模型组60.12±0.03*0.63±0.04*桂枝茯苓丸组70.28±0.09＃0.30±0.02＃EVP4593 组80.27±0.06＃0.39±0.02＃△桂枝茯苓丸+EVP4593 组70.38±0.04＃△▲0.27±0.03＃△▲

3.6 桂枝茯苓丸对COPD 小鼠肺组织NF-κB/Snail通路相关蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组小鼠肺组织p-IκBα、p-NF-κB 和Snail 蛋白表达升高（P＜0.05），p-IκBα/IκBα 和p-NF-κB/NF-κB 比值升高（P＜0.05）； 与模型组比较，各给药组小鼠肺组织p-IκBα、p-NF-κB 和Snail 蛋白表达降低（P＜0.05），p-IκBα/IκBα 和p-NF-κB/NF-κB 比值降低（P＜0.05），其中以桂枝茯苓丸+EVP4593 组最为显著（P＜0.05），见图4、表6。

图4 各组小鼠肺组织NF-κB/Snail 通路相关蛋白条带图Fig.4 Bands of NF-κB/Snail pathway related proteins in mouse lung tissues of each group

表6 各组小鼠肺组织NF-κB/Snail 通路相关蛋白表达比较（±s）Tab.6 Comparison of NF-κB/Snail pathway related proteins expressions in mouse lung tissue of each group （±s）

表6 各组小鼠肺组织NF-κB/Snail 通路相关蛋白表达比较（±s）Tab.6 Comparison of NF-κB/Snail pathway related proteins expressions in mouse lung tissue of each group （±s）

注： 与空白组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与桂枝茯苓丸组比较，△P＜0.05； 与EVP4593 组比较，▲P＜0.05。

组别动物数/只p-IκBαp-IκBα/IκBαp-NF-κBp-NF-κB/NF-κBSnail空白组80.13±0.010.17±0.010.10±0.020.19±0.010.12±0.01模型组60.66±0.06*0.88±0.07*0.57±0.04*0.95±0.07*0.58±0.05*桂枝茯苓丸组70.37±0.04＃0.48±0.06＃0.28±0.03＃0.55±0.06＃0.32±0.03＃EVP4593 组80.44±0.03＃△0.59±0.04＃△0.37±0.02＃△0.73±0.06＃△0.43±0.05＃△桂枝茯苓丸+EVP4593 组70.27±0.02＃△▲0.39±0.06＃△▲0.21±0.02＃△▲0.44±0.03＃△▲0.26±0.01＃△▲

4 讨论

肺不仅多气，还是多血、多津之脏，其性易瘀易滞，在六淫等外来之毒的作用下，肺络受损，反复外感，留痰生瘀，导致络气不畅，日久痰瘀化毒，积伏络脉，痹阻肺络，形成COPD 气道重塑的病理状态［10］。桂枝茯苓丸出自张仲景的《金匮要略》，由桂枝、茯苓、赤芍、牡丹皮及桃仁组成，是活血化痰、消癥通络之名方［17］，可使瘀祛痰消、络通毒除，气道通畅，其应用符合“毒损肺络”的中医病机思路。

COPD 气道重塑涉及网状基底膜增厚、胶原沉积、气道纤维化和平滑肌细胞增生等过程［18］。各种炎症因子和生长因子参与了气道的频繁损伤-修复，慢性炎症是气道重塑的重要原因［19］。本实验结果显示，COPD 小鼠肺组织IL-6、IL-8 和TNF-α水平升高，同时伴有大量炎性细胞浸润和细胞外基质（extracellular matrix，ECM） 胶原沉积，符合中医中“毒损肺络、痰瘀痹阻” 的认识； 经桂枝茯苓丸干预后，COPD 小鼠以上指标得到明显改善，提示桂枝茯苓丸可解痰瘀之毒，畅通肺络痹阻。

EMT 是上皮细胞失去其细胞粘附和顶端-基底极性的特征，并获得迁移、侵袭和产生ECM 成分的间充质细胞特性［20］。EMT 的生物标志包括Ecadherin 的丢失，和（或） 间充质标志物的增多，如N-钙粘蛋白、波形蛋白和α-SMA 等［21］。研究表明，EMT 所引发的上皮细胞功能异常在COPD 气道重塑中起重要作用［22］。

NF-κB 是一种具有多向调节作用的核转录因子，正常情况下与IκBα 形成复合体，处于被抑制状态。一些胞外信号 （包括IL-6［23］、IL-8［24］和TNF-α［6］等炎性因子） 在膜受体的介导下，可激活IκB 激酶，进而磷酸化IκBα，使其泛素化降解，最终导致NF-κB 解除抑制而激活，易位到细胞核以促进多种转录因子表达［25］。Snail 蛋白是一种锌指转录因子，已被证实可直接作用于E-cadherin 并抑制其表达，还可上调Vimentin 和Fibronectin 等间充质标志物，从而诱导EMT 的发生［26］。现有研究表明，NF-κB 可通过直接激活、促进转录和阻断泛素化降解等途径增加Snail 的水平［6，8，26-28］，NF-κB/Snail 通路在EMT 中的作用已得到广泛共识。本实验结果显示，COPD 小鼠存在气道重塑，同时伴有p-IκBα、p-NF-κB 和Snail 表达增加，p-IκBα/IκBα和p-NF-κB/NF-κB 比值升高，E-cadherin 表达降低和α-SMA 表达增加，并且以上指标均可被EVP4593 （NF-κB 信号阻断剂） 所抑制，提示NFκB/Snail 通路介导了EMT 的发生，并可能是COPD小鼠气道重塑的重要原因。桂枝茯苓丸组与EVP4593 组结果相似，提示桂枝茯苓丸可通过抑制NF-κB/Snail 通路介导的EMT 来改善COPD 气道重塑。两者合用疗效比单用更好，提示桂枝茯苓丸的治疗机制可能涉及多种途径，还有待进一步探索。

综上所述，本研究证实了NF-κB/Snail 信号通路所介导的EMT 参与了COPD 气道重塑，而桂枝茯苓丸可能通过“活血化痰、消癥通络” 改善以上过程。